第一代合成微孔硝酸纤维素膜由威廉.舒马赫使用醚和醇的特殊蒸发方式处理完成。1907-1912年这种膜的基本制备技术开始在实验室进行，随后向醋酸纤维素与硝酸纤维素等合成膜系统的工业化产品方向发展。该技术首次应用于工业化产品生产始于1929年德国赛多利斯的哥根廷大学。美国的工业化膜产品始于加州理工大学的理查德.席格迪蒙迪，他对其进行了实验研究取得了相关专利，并于1925年获得诺贝尔化学奖，20世纪50年代初，这项技术成果被转让给Millipore公司。
膜化学
对于横向流动试验条，膜必须在检测线和质控线上不可逆地结合捕获试剂，制造膜的聚合物决定了其大部分的结合特性。硝酸纤维素膜（NC膜）的生产原材料是呈纤维束状的硝酸纤维素，制造该膜的硝酸化程度通常为每个糖单体上包含1.8-2.3个硝酸基团（主要由硝酸纤维素构成），用NO2替代纤维素上的羟基可增加材料疏水性。硝化的程度不仅会改变最终膜的结合特性，对制造过程也有影响。对于膜的制造，需要将聚合物溶解在二元溶剂系统，其中一种溶剂可以溶解聚合物，而另一种溶剂（非溶解剂）对NC的溶解能力非常有限。在控制环境湿度和温度的条件下，将原材料混合物以薄薄一层均匀散布在连续滚动的钢带或其他连续缓慢移动的表面，此时易挥发的NC溶剂便开始蒸发。最关键的孔形成过程正是发生在这个蒸发阶段。在这个过程中，溶解在溶剂中的聚合物沉淀在较慢挥发的液体（非溶解剂）周边的固体基质上，形成了孔。从而最终形成了一个海绵状聚合物网架结构。接下来将膜置于滚筒上进行干燥，干燥的温度应足够高，以保证残留的溶剂能够完全挥发并进一步“硬化”NC聚合物。当较慢挥发的非溶解剂完全挥发干净以后便形成微孔膜。微孔膜的空体积（孔密度）为70%-80%。这时，膜的水含量保持在5%-10%，这些水存在于聚合物基质间，而不是在膜空隙中。
如何将活性捕获分子吸附于检测线（T线）和质控线（C线）上是生产一个灵敏可靠的免疫检测试剂的关键。尽管自从NC膜被首次用于蛋白吸附膜开始，就已开展了大量的研究工作，然而其吸附的真实本质仍不知晓。现在广泛认同的是硝酸酯强偶极和肽键偶极之间的疏水作用，氢键结合以及静电作用起了决定作用。然而，究竟何种作用起决定因素仍存在分歧。目前存在两种合理的模型。第一种模型提出蛋白最初通过静电作用吸附到膜表面，而后氢键结合和疏水作用的联合作用用于维系膜和蛋白的长时间结合。虽然这一点很难证实，然而这一模型和已经公布的实验数据非常吻合，所以这种模型被广泛认同。另一模型则指出最初的蛋白吸附是通过疏水作用介导的，而静电力则维系了蛋白的长时间吸附。这一点也和许多的发表数据相吻合。然而，静电隔离机制并不能完全解释为什么通过干燥或使用乙醇固定操作时蛋白粘附仍可保持长时间的稳定。硝酸纤维素聚合物不存在任何碱性和酸性基团，pH对膜吸附的影响主要通过改变蛋白特性来实现，而并非改变膜的属性。不管这些作用力的联合对蛋白吸附的作用有多大，研发人员一旦尝试优化NC膜的蛋白吸附作用，这些因素都必须纳入考虑范畴。重要的是要认识到捕获试剂是在液体就地蒸发后保留在NC膜上的，这一过程并不意味着蛋白质实际上在分子水平上吸附到硝化纤维素上。在将捕获试剂划到硝酸纤维素膜时，包被缓冲液中不要使用或使用浓度<0.01% v/v的表面活性剂如Tween 20和Triton X-100，因为这些化合物可能物理干扰蛋白质与硝酸纤维素之间的分子接触。如果在制造过程中将这些化合物过量添加在捕获试剂缓冲液中，试剂条跑板时信号可能会开始显现，随后随着捕获试剂从硝酸纤维素上脱落并向下迁移而消失。如果需要防止非特异性相互作用或减少背景，应将其放入样品垫中。
蛋白吸附能力
在大多数情况下，膜的蛋白质结合能力是由可用于吸附捕获试剂的膜表面积决定的。膜的表面积由孔隙大小、孔隙率（三维结构中的空气量）、厚度决定，以及在一定程度上由聚合物特有的结构特征决定。在其他参数相等的情况下，表面积随孔隙尺寸呈非线性减小，随厚度呈线性增加，随孔隙度呈非线性增加。例如，0.1µm硝化纤维素膜的表面积大约是10µm膜的10倍，而不是100倍。孔径和内在表面积的关系表现为表面积与孔径的平方根呈反比。多孔结构的内部表面积通常报告为平方米/克。对于膜材料，确定克/平方米的基础重量相对容易，将内表面积乘以基础重量可以得到表面积比，表示为每平方米内表面积与每平方米表面积之比。对于孔径非常小(约0.1µm）的膜，这一比率可能超过2,000。用于免疫层析应用的膜，其表面积比通常在50到200之间。蛋白质在给定表面积上的装载能力取决于蛋白质结构的紧致性及其Stokes半径（有效直径）。对于IgG，加载能力约为1µg/cm2。将IgG的加载能力（1µg/cm2）乘以膜的表面积比（50-200），得到的IgG结合能力约为50-200µg/cm2。在典型的测试条中，测试线宽为1毫米，如果测试条宽为1厘米，则每个测试线可结合的捕获试剂量为5-20µg（0.1厘米宽×1厘米长= 0.1平方厘米）。这比大多数检测所需的量大10到100倍。因此，在测试设计中，蛋白质结合能力通常不是问题。另有文献说能吸附到设定表面积上的实际蛋白量与蛋白分子大小密切相关，IgG分子可认为是一种直径约15nm，厚度约为3nm的透镜样的凹球形分子，由于吸附的方向是随机的，因此表面单层IgG最大吸附量为0.4μg/cm2。对于比表面积率SAR在63到110之间，宽1mm，长1cm（0.1 cm2）的检测线而言，其IgG蛋白吸附量在2.52μg到4.4μg之间（0.1×SAR 63×0.4到0.1×SAR 110×0.4），这一吸附量远远超过了实际检测中捕获抗体的总量。
注：一般每人份检测线宽1mm，长3.3mm，则表面积为0.033cm2，能吸附的IgG抗体量为：0.03cm2×63×0.4ug/cm2=0.87ug到0.03cm2×110×0.4ug/cm2=1.45ug，高于实际应用中IgG抗体的包被量0.3到0.45ug每人份。
毛细管流速和流动动力学
毛细管流速是当样本在膜的加样端被引入时，样品前部沿膜条移动的速度。这个值很难准确测量，因为速率随着液体沿膜的上行呈指数衰减，假设液体前沿移动第一个1cm需要x秒，那么移动下一个1cm则需要耗费2x秒。一个更容易测量的参数是毛细管流动时间，是指液体流过确定长度的膜条所需的时间，该值通常表示为sec/cm，与流量成负相关，流量表示为cm/sec。侧向流动速度（也称爬速）取决于膜多孔结构的性能，随孔径的增大提升。对于免疫检测，使用的膜的流速是影响测试结果的一个重要因素。对于给定的膜、捕获试剂以及分析物浓度的组合，降低流动速度往往能提高检测的灵敏度。膜侧向爬速和分析物表观浓度之间的关系遵循平方反比定律，倍增侧向爬速可将表观分析物浓度降低为原先的25%。因此，如果研发人员需要达到某个较高的灵敏度，应该尽可能选择最小标称孔径的膜。
毛细管流速对信号形成的影响
侧向流动测试经常被忽视的一个方面是该系统是动态的，试剂组分在多孔材料中不断移动，抗原一旦通过捕获线的抗体就不能结合。因此，在检测线（T线）和质控线（C线）上的免疫复合物的形成取决于这些成分在分子水平上足够接近以相互结合的有限时间段。毛细管流量决定了这个时间段的长度。样品中被分析物的有效浓度与流速变化的平方成反比。当流量为1倍时，R = k[Ab][Ag]，如果流量翻倍，它们的有效浓度发生变化，因为它们只花一半的时间在足够近的距离上彼此结合，在流量为2倍时，R = k[0.5 x Ab][0.5 x Ag] = 0.25 k[Ab][Ag]，复合物量的相当于将Ag的浓度降低到原始流速的四分之一。例如，从一个流速为180秒/4厘米的膜转换到一个流速为90秒/4厘米的膜，会导致检测灵敏度下降四倍。如果毛细管流速从X增加到1.25X，则分析物的有效浓度降低了36%（1-（1/1.252））。在某些情况下，可以通过增加捕获试剂和标记物颗粒的浓度来补偿灵敏度损失，但这种补偿也有缺点：试剂成本增加、特异性降低以及高背景干扰。
另一个重要的考虑因素是，毛细管流量随着样本上行距离的增加呈指数减小。通常，液流前沿从X厘米移动到2X厘米所需的时间是从0厘米移动到X厘米所需时间的两倍。换句话说，如果移动1厘米需要1分钟，那么移动下一个厘米将需要2分钟。这一现象的含义是，检测线的位置对可实现的灵敏度有显著的影响。随着捕获线位于离加样孔更远的位置，分析物通过捕获试剂线的流量变慢，免疫反应更充分，样品中分析物的有效浓度更高，由于这个原因，将捕获线的位置定位至离加样孔相对较远似乎是有利的。依据这一现象，在多重分析中，每个测试线上的反应动力学也会有所不同。可能需要增加第一个测试线的捕获试剂和检测器颗粒的数量，以弥补样品将比下游更快的事实。例如，对于单条联检的产品如甲乙流抗原检测，理论上靠近C线的乙流灵敏度会高于甲流。
最后，塑料外壳的设计也会通过压实程度对流速产生影响，视窗的位置距离加样孔的远近也同样通过流速影响最终的灵敏度。
毛细管流速影响整体检测性能，随着毛细管流速的增加，给定体积的捕获试剂液体在膜上扩散更远，这是在膜上优化试剂条的方案时需要考虑的一个关键点。应用于快速流动膜的试剂线将比应用于慢流动膜的相同线更宽。这导致信号扩散到更广泛的区域，使信号变得微弱。因此线宽的变化可能会对灵敏度极限下的性能评估产生不利影响，一条较宽的线可能低于肉眼可见的阈值。
洗涤剂和表面活性剂
硝酸纤维素膜天然疏水，我们购买使用的膜在水中容易润湿是因为生产过程中已向膜中添加了洗涤剂或表面活性剂。所用表面活性剂的类型和量通常由膜制造商确定，以确保与铸造工艺兼容，并广泛适用于侧向流动分析，这也可能是不同厂家膜之间存在差异的原因，以及开发不同产品可能适用不同膜的原因。研发人员使用这些膜开发产品，应该了解膜中洗涤剂和表面活性剂对膜的性质以及可能对产品的影响，如果使用某个膜开发产品遇到问题，也许简单的更换其他厂家的膜就能解决。
对毛细管流速的影响：为了使膜具有湿润性，需要达到润湿所需要的最低浓度的表面活性剂或洗涤剂。一旦达到这一浓度，进一步增加对湿润性的影响不大。然而，通常需要稍高的浓度以实现均匀的毛细流动。如前所述，制造商在生产过程中会固定膜中的浓度。
对蛋白质吸附的影响：表面活性剂和洗涤剂会影响蛋白质的吸附，无论是在膜中还是在捕获试剂缓冲液中。如果膜中的浓度太高，它们会掩盖硝化纤维素，从而阻止吸附，制造商在生产膜时会避免这种情况。在捕获试剂缓冲液中添加表面活性剂和洗涤剂会带来更多问题，尤其是当表面活性剂的添加浓度超过临界胶束浓度时，Tween20、TritonX-100、甘油、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙二醇（PEG）可能会通过优先吸附到膜上或在蛋白质分子吸附前与其形成复合物而减少蛋白质结合，在捕获试剂固定化之前，应尽量减少或完全避免使用这些物质。如果作为阻断过程的一部分将其应用于膜上，则其浓度应尽可能低，以防止捕获试剂被置换（Tween20和TritonX-100的浓度<0.05%v/v，甘油的浓度<0.1% v/v，聚乙烯醇、PVP和聚乙二醇的浓度<0.5%w/v）。离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，在浓度远低于降低蛋白质与膜结合的浓度时，是非常有效的润湿剂。
对试剂条跑板的影响：当样本和试剂上行到膜上时，试剂溶液进入膜的便捷性和一致性受膜润湿性的影响。提高膜中洗涤剂浓度至超过润湿所需的最低浓度，不仅增强侧向流动的一致性，还可提高试剂应用的一致性。但过高的表面活性剂会出现上面所述的负面影响，在最佳洗涤剂浓度下，只要操作流程和环境条件得到优化并保持不变，检测线的显色均一度和灵敏度能达到最佳。
对T/C线宽的影响：膜上的洗涤剂一旦达到最低需求浓度，膜就会持续湿润，T/C线的质量也会最大化。但是，还存在一个控制捕获试剂在膜上扩散程度的浓度上限，随着膜中洗涤剂或表面活性剂含量的增加，T/C线会变得更宽。虽然捕获试剂溶液中的蛋白质可能不会像液体那样扩散得那么远，但仍然会产生一定影响。一旦发生扩散，可能会导致信号强度下降，从而可能降低整体检测灵敏度。因此，制造商会注意不要超过湿润剂的最佳浓度。
液体扩散与蛋白质扩散
为了获得最佳的检测性能，研发时应该控制捕获试剂在膜上划线的宽度，因为相同的标记物颗粒集中在更窄的区域内，信号强度随着试剂线宽度的减小而增加。捕获线的宽度主要由划线时的液体与膜之间的接触区域决定，以IgG为例，如果试剂溶液中的蛋白质浓度接近膜的饱和水平（约5 mg/mL IgG），则捕获试剂和液体线的宽度将相同。硝酸纤维素膜的蛋白质结合能力范围在50到200µg IgG/cm²之间，或划线浓度4-15 mg/mL，抗体溶液很少接近这一浓度范围的低端，所以在大多数情况下，捕获试剂线的宽度比划线时液体线的宽度要窄，因为蛋白质分子一旦接触硝酸纤维素膜，几乎会立即吸附。如果硝酸纤维素已经饱和或膜被表面活性剂或其他物质预封闭，蛋白质分子才会在膜中横向迁移，表现为捕获线宽度会宽于划线时的液体宽度。在某种程度上，膜的毛细管流速影响条带扩散，随着流速的增加，划线时液体线会变宽，因此，捕获试剂线也变宽。这种效应可以通过修改捕获试剂缓冲液和/或降低膜中的去污剂浓度来克服。当捕获试剂溶液被划到膜上时，它们会横向和向下渗透，最终填满由所施加液体体积（以µL/线性厘米表示）、膜床体积以及孔隙填充效率定义的空间。例如，如果分配速率为1µL/cm，膜床体积为10µL/cm²，且孔隙完全填充，则计算出的带宽为0.1厘米。
膜的保存
一般刚生产出的成品膜含有5%～10%的水分，关于膜的老化机制，理论上认为是因为膜上水分的蒸发使膜变得疏水、带电荷并质脆。一般膜的储存要求是避光、密封、保持一定的环境湿度(45%～65%)。这种条件下成品膜一般可放置两年，长期储存时，温度应在10至25°C之间。相对湿度应在30%至70%之间，且不应暴露于冷凝大气中，如果成品膜进行了二次封闭处理则根据具体的稳定性试验进行评估。应防止硝酸纤维素膜接触有机溶剂蒸汽，有机溶剂会吸附到硝酸纤维素膜上，使其变得疏水。
硝酸纤维素膜（NC膜）的应用经验
硝酸纤维素膜是侧向层析试剂的重要功能部分，膜必须能够吸附足量的蛋白以保证能有显著紧凑的捕获线形成，同时，非特异性背景应该足够低，以方便地进行结果读取。硝酸纤维素膜有不同的等级和孔隙度，许多制造商根据毛细管流动时间来标记各种等级，即试剂在膜上前进4厘米所需的时间（秒），快速膜如密理博HF75，表示试剂在膜上前进4厘米用时75秒，慢速膜如赛多利斯CN140，表示试剂在膜需要140秒（约2倍时长）才能前进相同的距离。一些制造商还可能以孔径（μm）标记其等级，孔径越大膜速度越快（毛细管流动时间越短），孔径越小膜速度越慢（毛细管流动时间越长）。使用较慢的膜（较小的孔径/较高的毛细管流动时间）将增加检测时间，但缓慢的速度增加了标记物颗粒、分析物和捕获试剂之间的孵育时间，这反过来又可以提高灵敏度。更快的膜（更大的孔径/更短的毛细管流动时间）减少系统中试剂之间的孵育时间，产生更快的结果。粘性样品（如唾液、未稀释的血浆或全血）比非粘性样品（如尿液）迁移更慢，使用更快的膜可能流动得更好。
需要注意的是，如之前所提到的，不同厂家的膜工艺和材质有差异，有些膜是用专有的表面活性剂和其他化学物质的混合物处理的，因此在不同产品的应用上就可能存在差异，另外这些膜的合成也是有批间差的，使用之前还要检查批次之间的变异性，以确保批次之间结果的一致性。在开发某个病原体抗原检测产品时，使用一直沿用的某个厂家的NC膜，无论怎么优化工艺灵敏度总是不满足要求，且临床阴性样本假阳性的现象，通过在捕获缓冲液中添加0.5%BSA略有改善，但仍不能解决，最后发现是膜的问题，更换为另一个厂家的膜不但没有假阳性，灵敏度也显著提升。从假阳的现象本质分析，假阳来自于T线的捕获抗体与金标记的抗体之间的非特异性吸附，应该与活材的性质有关，但是三个供应商的不同抗体对均出现假阳性就很难用这一理论解释，自然就会想到是体系中的共性问题，例如胶体金、NC膜、结合垫、样品垫、复溶液配方等。但是在使用相同材料和工艺的其他产品上并未出现类似的假阳性现象，只是将NC膜更换后就解决了这一问题，背后的理论仍不清楚。这就提示，也许活材和辅料（例如NC膜）之间有相互适配的现象，意味着在遇到类似问题的时候，不防更换关键辅料进行验证。
用抗DNP单抗划线不同厂家不同型号的NC膜，荧光微球标记DNP-BSA，用半条试验方法评估不同NC膜的吸附性、精密性，精密性做了10个重复。半条试验的具体做法是没有样品垫和结合垫，将荧光微球标记的DNP-BSA放到微孔板中，将已划过抗BNP抗体的NC膜条裁好放入微孔中（如下图），此时荧光微球标记的DNP-BSA直接上行到NC膜上，被C线位置的抗BNP抗体捕获，待反应15分钟结束时，将膜条放入卡壳，读取荧光值。用半条实验评估NC膜的好处是可以排除样品垫和结合垫的材质、处理工艺、组装工艺、结合垫的释放均一性等因素对NC膜评估的影响，可以真实的比较出各个厂家和型号NC膜的差异。
第一次试验因为荧光微球标记不完全相同，仅看精密性。结果显示，不同NC膜的精密性CV范围为2.37%-6.13%。这个结果明显低于成品层析试剂的精密性范围（约10%-15%），从侧面也反应出层析试剂的精密性问题主要不是来自于NC膜，更大可能是来自于结合垫上标记物的释放不均匀。
第二次试验重点比较了不同NC膜的信号值，精密性只做了2个重复，数据仅作参考。结果显示，不同NC膜的信号值有差异。此次重复精密性CV更优，大部分在4%以下，再次说明了层析试剂的精密性问题主要不是来自于NC膜。
请注意，以上仅是个人在某个特定材料上的实验结果，不代表您在产品开发中会得到相同的结论，仅供参考和提供试验思路。本实验也从侧面反应出已有众多国产厂家开发出了质量可靠的NC膜可供选择，不再完全依赖于进口。
来源：IVD二十载
声明：本网站注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！
