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成功的制造需要整合材料、试剂、处理工艺和组装操作，整个过程可以完全手动、全自动，或者结合手动和自动步骤。手动步骤要求以批次模式处理材料，而自动化则允许连续处理。选择使用批处理还是连续处理取决于要生产的数量以及可用于员工和设备的资金。制造过程的大致步骤如下所述：

优化捕获试剂缓冲液

用于稀释捕获试剂的缓冲液需要优化，以确保蛋白质吸附不受影响，试剂反应性得以保留，膜的流动特性不变。最终，捕获试剂必须满足灵敏度、特异性和稳定性的要求。根据试剂的性质，缓冲液配方可能有较大的灵活性。而某些抗体和合成抗原则可能需要特定的配方来维持结构稳定性和反应性。应优化的溶液参数如下：

缓冲液选择：捕获试剂的溶液应始终有缓冲能力，至少每批试剂的pH值应相同，即使它不是最佳pH值。许多缓冲液包括磷酸盐、硼酸盐、TRIS和碳酸盐在内的溶液可用于控制捕获试剂的pH值。一些较为少见的缓冲液也可能更好，但重要的是要知道捕获试剂是在缓冲溶质存在的情况下干燥在膜上的，问题可能源于划膜后干燥蒸发过程中活材和溶质发生的化学相互作用，此时这些溶质的浓度会暂时非常高。例如，如果捕获缓冲液用一元胺如TRIS或甘氨酸缓冲，捕获试剂中的酸性氨基酸残基（谷氨酸和天冬氨酸）与缓冲分子的-NH3+基团之间可能会发生盐桥作用，从而降低捕获试剂结合分析物的能力。钠作为阳离子比钾更好，原因相同。对于适用于pH值范围为4到6的捕获试剂，可以使用醋酸铵，因为醋酸和氨都是挥发性的，蒸发后几乎不留任何残留物。

PH选择：随着捕获试剂溶解度的降低，抗体向膜上的结合倾向增加。蛋白质的溶解度受pH值影响，当蛋白质没有净电荷时，即等电点pI处，其溶解度最小。因此，为了最小化蛋白质的溶解度并保持溶液稳定，应将pH调整至捕获试剂pI值的±1单位。大多数抗体的等电点在pH 5.5到7.5之间。使用pH 7.0-7.5的缓冲液可能接近最优。当捕获试剂的pI未知时，最佳pH值需要通过实验确定。

离子强度：缓冲液的离子强度应尽可能降低。溶液中的离子会干扰膜与捕获试剂之间的静电相互作用。此外，生理浓度的缓冲盐和氯化钠可以促进大多数蛋白质的溶解度，并减少硝酸纤维素膜的疏水吸引力。最后，随着捕获缓冲液浓度的增加，膜上蒸发后残留的固体量也会增加，孔隙中的固体残留物会延迟膜的润湿过程，并在测试运行时改变其流动特性。因此，缓冲液的浓度应降至维持稳定pH值所需的最低水平（通常为<10 mM)。除非绝对需要以保证蛋白质的溶解度或稳定性，否则应尽量避免使用氯化钠。

甲醇、乙醇或异丙醇的使用：向试剂应用溶液中添加少量的醇类(1%至10%体积比甲醇、乙醇或异丙醇）有三种有利的作用。首先，醇类可以通过降低溶液粘度、降低溶液表面张力（这两者都能促进溶液进入膜），以及减少静电排斥，显著提高捕获试剂划膜的一致性。其次，加入少量醇类会降低蛋白质的溶解度，但不会引起变性和沉淀，它还能促进蛋白质在硝酸纤维素膜上的吸附。第三，即使低浓度的醇类也能增强干燥和蛋白质固定的效果。添加醇类的好处应通过实证来确定。

表面活性剂的使用：商品化的NC膜一般都经过表面活性剂亲水处理，偶尔，捕获试剂缓冲液会置换膜中已存在的表面活性剂，导致试剂T/C线比未处理的膜相邻区域湿润得更慢。当这种情况发生时，样本流动前沿会变形。在极端情况下，流动前沿会绕过捕获试剂线形成反白，或阻止液体沿线路流动。为了防止这种情况，有时加入少量洗涤剂（例如0.05% SDS或0.005%Triton™X-100)以促进试剂线的重新湿润是有效的。

惰性蛋白的使用：捕获缓冲液中一般不添加惰性蛋白BSA，因为这些蛋白会抑制捕获活材对NC膜的吸附导致灵敏度降低，但是有两种情况可以考虑使用，一是对于竞争法的试剂，捕获材料的用量非常少，添加一定浓度的BSA可以使显色更均匀。二是消除非特异性干扰，尤其是对于一条检测多个标志物的设计，不同的捕获和标记活材之间可能会发生非特异性吸附，添加0.5% BSA可以抑制这种非特异性干扰。 

简要总结：1.尽可能降低缓冲液的摩尔浓度，最好<10 mM。2.从缓冲液中去除氯化钠和其他盐类。3.消除表面活性剂和洗涤剂，如Tween®20和Triton™X-100。如果盐和洗涤剂对于捕获试剂在溶液中或干燥形式下的稳定性至关重要，应以最低必要浓度加入，如万分之五以下。4.离子型洗涤剂，如SDS，浓度<0.1% w/v可以安全地使用，以减少非特异性蛋白质相互作用并促进最终检测中捕获试剂线的重新润湿。5.消除其他添加剂，如惰性蛋白，除非必须。6.为了帮助试剂溶液均匀分配，缓冲液可加甲醇/乙醇/异丙醇。7.将捕获试剂的浓度调整在一个能够产生最终测定所需线宽的水平，同时达到规定的灵敏度和特异性。

划膜

湿度和静电作用的影响：湿度影响硝酸纤维素膜在制造过程中的处理。在低湿度条件下，硝酸纤维素膜会产生显著的静电荷。这导致膜被不同表面吸引或排斥。在这种情况下，未背衬的膜非常难以处理，而有背衬的膜通常更容易处理，因为背衬的重量可以克服静电作用力。无论是哪种类型的膜，灰尘和污垢颗粒都会吸附到膜上，且很难在不损坏膜表面的情况下清除。静电荷的更严重问题是干扰划线，水滴天然带负电，如果水滴被静电排斥，试剂线宽度可能会有显著变化。在极端条件下，线可能会断裂，变成不连续的线。对于喷射划线系统而言，这个问题更为严重，因为液体流被转换成气溶胶。对于接触式划线设备而言，这通常不是问题，但有时也会出现不连续的断点。一般来说，在湿度过高的条件下划线比在湿度不足的条件下更好。对于大多数制造商而言，这通常意味着在干燥月份需要对试剂应用区域进行加湿。当房间保持在标准室温（18-22°C）下的相对湿度约50%时，可以获得最佳效果。卷对卷系统在膜片经过滚筒和其他表面时，仅通过摩擦就会产生静电。在这种情况下，可能需要在膜片通过分配器尖端之前安装一个离子枪，离子枪产生的离子可以暂时消散静电。

优化划膜条件：无论采用何种制造工艺，划膜的过程都必须优化。需要考虑的变量包括：1.对于未背衬膜，选择划膜到哪一侧 2.对将要划膜的这一侧进行评估 3.捕获试剂分配速率（µL/cm）4.需要分配的捕获试剂浓度 5.捕获试剂稀释液（见前一节）6.干燥。当捕获试剂以浓度<100µg/mL分配时，不太可能使硝酸纤维素表面饱和，导致单个分子与膜结合，而相邻区域的硝酸纤维素仍保持开放状态。在某些情况下，特别是对于抗体，可观察到反应性的缓慢下降，这可能是由于随着时间的推移，分子在硝酸纤维素表面重新排列导致变性所致。向试剂缓冲液中加入非特异性蛋白可以用来稳定捕获试剂。通常将总蛋白浓度调整到1 mg/mL就足够了。选择增容蛋白很重要，它不应导致检测颗粒的非特异性捕获，也不应干扰捕获试剂的识别。牛血清白蛋白和物种匹配的免疫球蛋白通常是不错的选择。试剂溶液的最佳分配速率，通常表示为µL/cm，是几个因素的函数。首先，必须有足够的捕获试剂浓度以达到所需的特异性和灵敏度，一般抗体的划线浓度为1mg/ml。其次，捕获试剂线的宽度主要由所加液体的体积控制。当试图缩小线宽时，必须增加捕获试剂的浓度，以保持施加的质量不变。第三，泵分配的液体量必须与膜通过分配器尖端的速度相匹配，以确保单位距离内输送相同体积的溶液。这些参数可以通过多种组合进行测试，以达到所需的线质量。常用的划速度是1ul/cm。

最后一个考虑因素是划线的方法。对于非接触式喷射划线，尖端通常设置在膜上方固定距离处，一般约为50µm。如果膜厚度的变化过大，膜可能会与尖端接触，导致膜物理损伤。较小的变异性也可能引起液体渗透到膜中的动力学变化，这取决于条纹溶液与膜相互作用的性质。使用接触尖端划线时，一段柔软的管子会与液体同时拖过膜表面。如果尖端施加的压力过大，硝化纤维素上就会压出一条沟槽。如果沟槽太深，毛细作用可能会受到影响。膜厚度的变化也会导致沟槽深度不一。这个问题可以通过立体显微镜直观评估。在气喷系统中，加压空气在分配前被注入液体流中。液体以气溶胶的形式接触硝化纤维素。由于液滴非常小，它们对静电排斥更加敏感。必须考虑所使用的空气量。未通过膜消散的气压会横向扩散，同时携带气溶胶。膜厚度的变化也会导致问题，因为这会改变气溶胶覆盖的面积。随着喷嘴与膜之间的距离增加，气溶胶的分散度也会增加。

捕获试剂的干燥固定

彻底干燥膜以固定硝酸纤维素上的捕获试剂至关重要。背衬膜比无背衬膜需要更长的干燥时间。干燥效果取决于温度、湿度、气流和时间。真空干燥室是理想的选择，但在生产中很少实际可行。如果膜没有完全干燥，可能会导致捕获线上的捕获试剂丢失，尤其是在最终组装前如果对膜进行封闭或清洗时，用于封闭膜的蛋白质可能会置换未充分固定的捕获试剂。在连续干燥系统中，通常通过一个或多个干燥塔来干燥膜。干燥塔中的空气温度和气流速率与生产线速度和捕获试剂划线速率相平衡，以确保膜在最终卷绕前完全干燥。这可以在几分钟内完成。一旦膜干燥，应将其储存在4至20°C、相对湿度为<15%的环境中，以防止捕获试剂再水化。

膜的封闭（非必须步骤）

横向流动测试设计中一个常见的问题是在捕获试剂固定后是否需要封闭NC膜。市面上许多商业层析试剂盒并未封闭NC膜，因为样品中存在的外来蛋白质或添加到样品垫上的封闭剂通常足以防止检测试剂和分析物非特异性地吸附到NC膜上。如果需要封闭，许多封闭剂可能与测试兼容：0.1-0.5%w/v明胶、1-2%酪蛋白（w/v）、1-2%牛血清白蛋白（BSA）、1-2%免疫球蛋白（IgG）、0.5-1%聚乙烯比咯烷酮（PVP）（10-30 kDa)和0.1-1%聚乙烯醇（PVA）（8-10 kDa)。选择一到两种候选封闭剂后，最好通过实验确定最佳浓度。在选择特定的封闭剂时，重要的是要认识到这些物质通常有多种纯度等级和分子量。封闭过程的细节取决于整个制造过程，但都是在捕获试剂划到膜上并干燥后进行。在手动操作中，可以将膜条浸入封闭剂溶液中来分批处理，浸入过程必须足够缓慢，以允许空气从膜的孔隙中排出。对于背衬膜，封闭液必须从边缘渗入，完全湿润后膜条可以浸入水中。需要有足够的封闭液来完全浸没条带，并且封闭剂的量要足以覆盖暴露的聚合物。不建议重复使用封闭液，因为这会导致封闭剂耗尽。通常情况下只需让膜与封闭液接触1-15分钟即可。膜被封闭后，用弱缓冲液（例如5 mM 磷酸盐，pH 7.5)洗涤以去除多余的封闭剂至关重要，这一步骤常因疏忽而造成流量不均和流动前沿不均。残留的封闭剂会在膜上干燥形成晶体，物理堵塞孔隙，为了促进堵塞膜的再润湿，可以在洗涤缓冲液中加入低浓度的洗涤剂（0.01% w/v SDS）。在批处理过程中，膜条需浸入洗涤缓冲液中5到15分钟。相对于封闭所需的时间，洗涤需要更多时间，因为多余的封闭剂必须从膜中扩散到洗涤缓冲液中。在连续生产中，封闭步骤可以与捕获试剂的固定化进行整合，封闭溶液浴位于捕获试剂划线之后，按顺序排列。采用这种方法时有几点需要考虑：1.在捕获试剂划线和封闭浴之间是否需要一个干燥塔来固定捕获试剂？2.封闭浴的尺寸是多少？3.速度是否足够慢，以确保膜进入封闭浴时完全湿润？4.膜在封闭浴中的停留时间是多少？5.鉴于停留时间，封闭剂浓度需要如何调整？6.是否需要洗涤浴来去除膜上的多余封闭剂？7.封闭溶液的补充速率是多少？8.最终干燥塔中使用的空气温度和风量是多少？无论膜如何封闭和干燥，都应储存在4至20°C、相对湿度<15%的环境中，以防止重新水化。

制备结合垫

标记物缓冲液（复溶液）组成：用于将标记物颗粒施加到结合垫上的复溶液应尽可能简单。乍一看，这似乎不合常理，因为附着在标记物颗粒上的生物试剂在干燥后仍需保持活性。然而实际上，用于稳定水溶液中抗体和其他生物试剂的化合物通常与干燥储存不相容，要么是因为它们会在干燥过程中改变生物活性，要么是会在化学和物理上损害标记物颗粒。因此，标记物复溶液中不应使用盐和洗涤剂，虽然它们通常对整个测试功能是必需的，但应将其置于样品垫中，以使其在空间上与标记物颗粒分离，胶体金颗粒比乳胶微球对化学和物理损伤更敏感。推荐的胶体金颗粒复溶液为PH 7的2 mM硼酸盐，补充1%到10%的蔗糖或海藻糖。硼酸盐不仅提供缓冲能力，还具有轻微的表面活性剂性质，有助于颗粒的重新溶解。蔗糖（或海藻糖）则作为防腐剂和重新溶解剂。当标记物颗粒在糖的存在下干燥时，糖分子会在颗粒周围形成一层膜，帮助稳定生物结构。样品进入结合垫后，糖分子会立即溶解，将标记物颗粒从表面带入流体中。这种复溶缓冲液也适用于乳胶微球。

向结合垫上分配标记物：浸泡法是将一个扁平容器装满足够的标记物颗粒溶液，以允许浸没。应提前考虑容器的大小和所用溶液的深度，以便于处理而不又不浪费过量的标记物溶液。结合垫材应浸入溶液中并提起，让所有多余的液体回流到盘中，然后将材料平铺在非吸水表面上晾干。在卷对卷处理过程中，通常在线进行干燥。处理结合垫时，拉伸强度较弱的材料需要小心操作，以防断裂和起皱，玻璃纤维和纤维素滤材通常湿态比干态弱得多，合成纤维则没有这一缺点，此外，片材比滤条更不易受到机械损伤。浸渍过程中应使用镊子和戴手套的手处理材料。浸泡法容易出现边缘效应，另外如果结合垫本身的材质均匀性有差异，很容易导致浸泡上的标记物颗粒也有差异。除了浸泡法之外，用喷涂仪器将标记物粒子喷涂到结合垫上也是常用的方法，喷涂方法按照恒定定量的速度将检测物粒子分配到结合垫上，理论上均匀性比浸泡法更好。常用的喷涂参数是2.7ul-4ul复溶后的标记物粒子/cm。

干燥：为了使标记物粒子的性能达到最佳，需要尽快且尽可能彻底地干燥处理过的结合垫。具体选项如下所示：1.空气干燥。在不受控的房间中进行空气干燥仅应在研发阶段的实验中用于研究目的。除非在相对湿度<15%的干燥室内进行，否则不应将其视为常规制造过程。空气干燥不能算作完成，因为它无法去除与糖类和生物分子结合的水分，这些结合水会改变长期稳定性。2.在37°C下干燥2小时。补充加热有助于去除结合水。此方法适用于许多应用，且培养箱相对便宜。请注意，某些生物分子可能对热敏感，在孵育期间活性会损失。为了保持反应活性而缩短孵育时间时，必须权衡干燥的彻底性。3.冷冻干燥。此过程大大加快了蒸发速度，但冷冻可能会损坏颗粒结构。此外，冷冻干燥机必须具有足够的处理能力。4.真空干燥。此过程可加快蒸发速度，而不会产生冷冻的不良影响。需要真空泵和真空室。尽快蒸发水分的主要原因是减少标记物颗粒在基质中的迁移，因为标记物颗粒不是吸附到材料表面，没有化学力将其固定。因此，如果液体移动，颗粒也会倾向于移动。边缘效应是片材上一个众所周知的现象。这是由于纸张边缘优先蒸发，导致该区域吸收了更多的颗粒，当完全干燥时，边缘的颜色明显比中心部分更深。为了弥补这一效果，边缘会被从纸张上切掉，不用于试条组装。在开发定量检测方法时，上述技术往往不足以控制每个测试条中结合物量的一致性。为了减少这种不均一性，采用了一种制造策略，即直接将结合物颗粒喷洒到结合物垫上。这种方法有两个优点，首先，可以沿条带对所喷涂的结合物的数量进行标准化，而且数量多少可取决于结合垫材料床体积的变化。其次，可以采用自动化方式分配，从而充分利用连续处理大卷材料使效率提升。喷洒到结合垫上的一个潜在问题是，由于玻璃纤维材料的孔隙结构不规则，液体会在孔隙中扩散不均，可以筛选使用均匀性更好的结合垫材质，或通过并排喷射多条线来补偿这一问题，以平均化宽窄不一的扩散区域。

保存：一旦标记物颗粒被干燥到结合垫中，重要的是垫材应储存在相对湿度<15%的环境中。温度范围可从4到20°C，需注意相对湿度会随温度变化而变化。如果垫材暴露在较高湿度下，水分可能会与糖分子结合，形成糖浆，从而延缓颗粒的重新溶解，严重的会导致结合垫上标记物颗粒完全不能释放。

样品垫、结合垫、NC膜的层压

调校：为了试纸条正常工作，样品垫、结合垫和膜必须相互重叠（下图），以确保样品有连续的流动路径。为了试纸条能够稳定工作，这些重叠部分必须一致，包括层叠宽度一致，厚度一致，压力一致，以确保所有制造出的试纸条上的流动动力学均匀。然后，这些层叠好的试剂卡被切成特定宽度的单个条，以便直接包装或放入塑料外壳中。为什么重叠的一致性如此重要？从根本上说，这个问题与流动动力学有关。重叠的程度决定了样品如何从一种材料流向另一种材料。理想情况下，整个装置中的样品流动是层流，这一点对于样品垫、结合垫和膜尤为重要，因为液体会沿着阻力最小的路径通过装置。如果重叠部分操作不当，垫片可能会湿润，但其中仍存在样品未实际流动的区域，这可能导致标记物颗粒释放缓慢或以不均一扩散速率进入液体流，从而导致检测一致性出现问题。可以设置层叠方式，使标记物颗粒快速完全地从结合垫中溶解出来，或者更慢地溶出，关键在于建立并遵守每种材料重叠部分的位置和宽度，例如样品垫压住结合垫的部分如果有标记物颗粒，往往导致被压部分结合物释放缓慢或残留。在层压过程中，与粘合底板接触的程度同样重要，通常情况下，对于膜或吸水垫来说这不是问题，因为接触面积较大。但是对于样品垫和结合垫而言，与粘合剂的接触面积可能非常小，这些垫片本身通常就很小，且相当一部分面积用于重叠，如果与粘合剂的接触不足，裁条过程中的剪切力可能导致这些材料从卡上剥离。通常粘合底板会被预刻划，以便在特定材料层压前移除一层剥离衬纸，这样做的时候，衬纸的边缘可以作为铺设膜和垫片的参考点。刻划的位置应明确，并设定公差。同样，垫片和膜的宽度变化必须最小。在手动组装过程中，每添加一种材料后都应检查对齐情况。这可能会很繁琐，因为需要测量精度通常<2毫米，且精度需符合规格和公差要求。对所有组装好的卡进行100%测试是不切实际的。在卷对卷系统中，线性视觉系统可以连续监测定位，无需操作员直接干预。缺陷区域可自动标记并从生产线上移除。

层压：层压过程的关键方面是将材料正确地贴到粘合卡上但不压缩多孔结构。膜对过度压缩具有机械敏感性，因为孔隙结构的变化是不可逆的。在极端情况下，流动将完全被阻塞。垫材料不那么敏感，但过度压缩可能会损坏它们，并且影响流动特性。在批量生产过程中，可以使用一种称为翻盖层压机的设备进行层压。材料固定在可移动的臂上，而粘合卡则固定在可移动的平台上。通过旋转臂使材料与粘合卡接触。施加压力到臂上，材料便粘附到粘合剂上。层压也可以完全手工完成，在这里，限制因素往往是操作员在粘合卡上对材料进行对齐以及对材料施加压力的一致性。一毫米或更小的位移和不同程度的压缩可能肉眼无法察觉，但却会导致流动性能出现不可接受的变化。在连续过程中，卷对卷系统的工程控制装置会在材料通过压辊间隙时对其进行对齐。该间隙、施加的压力、温度和线速度均经过优化，以确保粘附力的同时不引起过度压缩。在最终确定工艺之前，应对多个批次的膜材料和垫片材料进行评估。

层压缺陷：层压缺陷以多种方式显现。样品垫、结合垫或膜的过度压缩表现为流动缓慢或无流动。标记物颗粒在膜上的不规则流动（前沿不整齐或呈条状流动）表明样品从结合垫转移到膜上的不一致（下图)。这可能是由于结合垫与膜之间的重叠不足或接触不一致所致。认识到样品垫或结合垫中出现的不一致流动是很重要的。如果吸收垫被过度压缩，当样品前端经过观察孔时，可能会出现正常流动，但当它到达吸收垫时减慢或停止可能不容易被用户察觉。

总结和结论

开发免疫层析试剂是复杂的，因为要生产一个性能优异的试纸条需要将大量的关键成分组合在一起。改变一种材料或试剂通常会影响其他材料的性能。最终，有必要了解每个成分如何对试纸条的整体性能做出贡献。改变捕获试剂浓度、标记物颗粒浓度以及待分析样品的体积是相对简单的。然而，设计实验以评估膜变化的影响则要困难得多。免疫层析法最重要的组成部分是NC膜，大多数检测性能受膜流速的影响，影响的程度和可接受的限度因检测方法、试剂和制造商而异。例如，使用高流速的NC膜，试剂条层析完成的时间最短，但它们可能需要更多的试剂且灵敏度降低，这可能适用于对速度要求高且试剂成本相对较低的妊娠测试。相比之下，使用低流速的NC膜，试剂条层析完成时间最长，这些检测方法可能会消耗较少的试剂并达到允许的最大灵敏度，这种情况可能是传染病检测中最理想的选择。其他类型的膜则会产生在速度、灵敏度和成本之间平衡不同的检测方法。

来源：IVD二十载

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