1.捕获线显色浅或扩散
1.1原因
（1）捕获试剂使用浓度太低：捕获试剂通常从包被处向外扩散，扩散程度通常由捕获试剂在固相和溶液中的分配系数决定，如果固相吸附占优势，捕获试剂扩散少；如果溶液的增溶效果占优势，那么捕获试剂扩散就远些。捕获试剂浓度低，蛋白倾向于向更远处扩散，捕获线宽度接近或宽于划线时液体润湿宽度，最终相同数量的标记物颗粒分布到更宽的范围，显色就会变浅。
（2）捕获试剂被样品液冲离膜表面：如果捕获试剂与膜之间吸附力太弱，或者缓冲液中表面活性剂含量太高，捕获试剂可能被样品液冲离膜表面。
（3）膜的毛细管作用（流速）太快：如果膜有很快的流速，会使吸附蛋白很快从吸附处扩散开。蛋白泳动越快，捕获线也将越宽。蛋白还将垂直渗透进入膜内，这些渗透进入膜内的蛋白大部分会被浪费掉，因为只有位于NC膜表面10um的蛋白才是可见的，这种横向和纵向吸附作用导致捕获线显色很弱。通过使用小孔径的NC膜或使用粘度调节剂可使检测线显色较深，但可能导致非特异性反应增加。
（4）捕获试剂只能与膜发生微弱吸附反应：膜孔径大小或者其表面特性使一些捕获试剂很难与膜发生反应，解决方法也很有限，最常用的方法是将捕获试剂偶联到载体蛋白上。
（5）捕获试剂亲和力太低：捕获试剂如果和目标分析物之间的亲和力太低则无法支持高效捕获，只能在研发过程中筛选合适的抗体，避免使用低亲和力抗体。只有在小孔径膜中可以使用低亲和力抗体，因为泳动速率较慢时捕获抗体与分析物的反应能达到最大化。
1.2解决办法
（1）使用小孔径的膜：能增加捕获线清晰度和显色度。孔径越小的膜表面积越大，吸附的捕获试剂越多，孔径越小的膜泳动速度越慢，捕获抗体有更多的时间与待测物质结合。
（2）使用不同膜：不同膜对于不同捕获材料具有不同的吸附特性。选择具有更好吸附特性的膜，对于特定捕获试剂来说，可以有效改善捕获线显色强度。
（3）使用较高浓度的蛋白：在缓冲液中提高捕获试剂浓度可增加试剂与膜的吸附性，从而提高显色。
（4）改变包被缓冲液配方：降低包被缓冲液的粒子强度，如使用10mM PB；避免或降低使用抑制捕获蛋白吸附的物质，如BSA、表面活性剂；使用共沉淀剂，如甲醇。蔗糖或海藻糖也会抑制有些捕获蛋白的吸附，使用量最好不超过2%。
（5）降低泳动速率（流速）：通过加入粘度调节剂或者使用更小孔径的膜降低泳动速率可有效提高溶液中分析物的浓度，进而提高捕获线显色。
（6）捕获试剂的交联：如果使用的蛋白分子量较低，使用交联剂可大大提高蛋白质结合能力。最常见的是将捕获试剂与载体蛋白BSA或KLH交联，或者将捕获蛋白用戊二醛进行自交联，例如链霉亲和素。
2.捕获线润湿不均匀
捕获线润湿不均匀本质上是因为捕获线比周围膜更加疏水（通常由于洗涤时膜中表面活性剂被冲掉造成），这种情况下可能发生“潜水现象”或“反白”，即当样品通过膜直达捕获线时，由于捕获线更高的疏水性，样品可能沿着捕获线下的衬板运行，因为塑料衬板相对来说具有更好的亲水性，然后重新侵入捕获线上面的膜中，结果就是导致没有或很少样品与捕获线反应，直接影响到检测灵敏度。
2.1原因
（1）膜干燥不均匀：NC膜的再润湿通常取决于干燥过程中膜的干燥程度。如果生产过程中干燥条件变化很大，那么膜的再润湿速度也会不稳定。含水样品会冲掉划线部位的水溶性物质，导致捕获线位置疏水。
（2）膜疏水性不均匀：造成捕获线润湿不均匀的最重要因素为膜疏水性的改变。膜的再次水化率很大程度上受膜表面疏水性或亲水性残留物的影响。这些残留物可通过膜的后处理引入（生产过程中亲水材料的加入或者包被缓冲液中引入润湿剂）。
（3）捕获材料本身的疏水性：有些捕获材料本身有较强的疏水性。
2.2解决办法
除了筛选更合适的NC膜和捕获材料之外，也可以通过工艺配方来尝试解决。
（1）改变使用的缓冲液配方：包被缓冲液配方中加入温和表面活性剂可改善捕获线在亲水环境中均匀显色，表面活性剂种类和浓度的选择是关键，0.05%以下的SDS、吐温20可以考虑。
（2）进行膜封闭：有三种封闭方法，一种是在捕获试剂包被到NC膜上之后对膜进行封闭；一种是在样品垫或结合垫中添加封闭剂；三是在包被液中添加表面活性剂。不同方法的特点如下表：
（3）改变膜：用表面活性剂处理过的膜比未经表面活性剂处理过的膜更容易出现捕获线显色不均一的现象。捕获试剂溶液可能从膜表面冲走表面活性剂，而润湿剂的丢失会明显影响捕获线的再润湿性能。当膜表面未添加润湿剂时，捕获线的润湿可能是均匀的，但是润湿速度会慢些。实际上商品化的膜很多都已经添加表面活性剂处理过。
3.捕获线太粗
如果捕获线太粗，会出现显色宽度明显增加，且显示明显的前边缘和后边缘，检测结果难以解释，没有经验的用户会不理解这种情况发生的原因。
3.1 原因
（1）捕获线扩散太远：如果所用蛋白倾向于保留在溶液中而非附着在NC膜上，那么蛋白可能随着缓冲液而移动。在这种情况下捕获线可能变宽或在中间弥漫，部分有利缘存在（俗称咖啡环效应），这是由于蛋白随着溶液流动，溶液中溶剂挥发后形成的蛋白浓度局部增高造成。
（2）加样时捕获试剂被冲走：如果蛋白对膜的吸附太弱，或者系统中含有表面活性剂或BSA，那么当样品沿着膜泳动时捕获线就会被冲走，接着游离蛋白会重新吸附在膜的捕获线处。
（3）所用蛋白过多：假设NC膜吸附了饱和的蛋白，那么多余蛋白就会向周边扩散。
（4）所用NC膜孔径太大：通常情况下蛋白被吸附在划线部位，如果膜的孔径太大，划线时蛋白随着溶液向周边扩散的速度会变大，捕获线就会变宽。
（5）捕获线包被后膜干燥不充分：如果包被后未充分干燥，捕获试剂就不能被有效固化，被测样品就可能冲走捕获试剂。
（6）划线量过多：捕获试剂如抗体的划线浓度一般为1mg/ml，划线量一般为1ul/cm，如果划线浓度过高，或者划线量过大，都会导致捕获试剂在NC膜上扩散更宽。
3.2 解决方法
（1）改变缓冲液配方：一是降低溶液中蛋白的稳定性，例如加入共沉淀剂甲醇；二是增加缓冲液粘度，含蛋白的溶液泳动越慢，蛋白与包被部位的吸附就越充分。
（2）使用小孔径硝酸纤维素膜：小孔径膜有更大的表面积，蛋白能最大量的吸附在划线部位，另外小孔径膜泳动慢，捕获试剂不易扩散更远。
（3）改变膜特性：选择具有较高吸附结合能力的膜有利于提高显色线条的清晰度。
（4）改变封闭条件：如果包被后对膜进行封闭，封闭剂可能会降低捕获线已经吸附的蛋白结合力。此时降低封闭剂浓度或调整封闭剂配方可能会有所改善。
（5）包被更少蛋白：降低包被蛋白的浓度，减少划线的量，如0.7ul/cm。
（6）提高膜的干燥度：蛋白与膜的结合强度最终由膜的干燥度决定。蛋白包被后更快和更彻底的进行膜干燥可减少捕获试剂扩散同时提高蛋白的结合力。
4.捕获线太细
捕获线太细可能会使结果判为阴性，线条太细很难对结果进行准确判读。如果线条最佳宽度在0.8-1mm，当捕获线宽度是0.2mm时，那么很难将结果判为强阳性。
4.1 原因
（1）划线后蛋白结合太快：一般划线后溶液在NC膜上留下的宽度范围会宽于捕获线本身显色宽度，但在划线后如果蛋白很快与膜结合就会导致捕获线显色太细。
（2）蛋白使用量不足：如果蛋白与膜有很好的结合，那么蛋白浓度太低就会导致捕获线太细，因为在所有蛋白有机会从划线处扩散之前就已被结合在一个很小的区域了。另外划线量少，如0.7ul/cm的划线量就明显比1ul/cm划线量的捕获线更细。
（3）捕获试剂亲和力太强：如果捕获试剂的亲和力太强，待测物质复合物在经过捕获线时就会在线前端被完全捕获，导致捕获线前端有显著的显色，而在后端显色明显降低，形成前深后浅的条带，肉眼观察就表现出显色线细。
4.2 解决方法
（1）添加非特异性蛋白：在缓冲液中加入非特异性蛋白，例如BSA，这种非特异性蛋白和捕获试剂与膜的结合性质相似，可以提供膜上蛋白结合位点的竞争，从而形成较宽的线条。
（2）增加使用的蛋白量：增加蛋白量可以产生较宽的线条，过量蛋白会移动到膜上更远的区域从而找到蛋白结合位点，使膜上更大区域达到饱和状态。
（3）使用大孔径膜：大孔径膜会加速捕获试剂的层析扩散，且比小孔径膜有更少用的表面积，因此产生的线条也会更宽。
（4）改变蛋白的缓冲液配方：如果调整缓冲液以增加蛋白可溶性，可使蛋白在溶液中保持更长时间且在膜上结合前移动到更远的范围，那么捕获线宽度就会随着蛋白溶解性的增加而变得更宽。
（5）改变膜：选择低亲和力的膜更有利于形成较宽的蛋白线条。
（6）增加划线量：划线量1ul/cm的捕获线宽度明显会宽于0.7ul/cm的宽度。
5.线条显色不均匀
虽然检测线条不均匀的结果看起来与检测线条显色太粗或太细没有太大不同，但造成这个问题的原因是完全不同的。
5.1 原因
（1）膜疏水性的变化：不管是包被前还是包被后，NC膜的疏水性都可能导致形成不稳定的捕获线。因为膜的疏水性可造成检测线中出现斑纹条或者显色不均匀线条。常见原因包括贮存不当的未封闭膜或者捕获线包被过程中封闭剂被冲掉。
（2）划线系统中的压力变化：划线系统中压力（或流速）的变化经常会导致线条宽度不均匀（团块现象）或线条显色不均匀。这种情况由于蛋白量的变化造成，这种结果在批内的重复性检测中很少被检测到。
（3）蛋白溶液未充分混匀：现象类似于划线压力变化出现的问题。
（4）蛋白沉淀：蛋白沉淀析出会导致蛋白浓度变化或膜被颗粒物堵塞，这些颗粒也会阻塞小口径喷头。
（5）试剂条中的流动被中断：NC膜的流动问题可归结于两个主要原因，一个是空隙被颗粒物堵塞，另一个是试剂条中各组分间连接接触不良。空隙堵塞会导致膜中尤其在捕获线处出现条纹或斑纹。因为液体沿膜是线性流动，在捕获线部位孔隙被堵塞就会使样品无法渗透进入，也就不会发生颜色反应。另外，快速层析检测的流动取决于检测系统中各组分部分间毛细管接触的连续性，如果各组分组成部分接触不好或根本不接触，那么相比于有很好接触的检测系统，通过试纸条的样品量就会明显减少，也会导致捕获线出现条纹或斑纹。例如结合垫释放不均匀导致的“stream”效应，金复合物随着样品呈现条状线型上行。
（6）贮存条件不当：不当贮存条件的主要影响是造成膜的失水。这种失水情况可由生产过程中的几个缺陷导致，分别为挥发性润湿剂的丢失（如果在制造过程中添加），膜表面残余水分的丢失（如果没有添加润湿剂），溶剂、胶黏剂或增塑剂于膜发生相互作用。很难确定具体是哪一个原因造成了失水现象额度发生，但这些往往会减少膜的层析速度或使膜的表面出现疏水性区域。
（7）膜孔径结构不均匀：膜孔径变化会导致膜宽度中流速和比表面积发生变化。这两个因素可导致捕获线显色强度发生显著变化。
5.2 解决方法
这个问题需要通过化学、机械或操作等多种方法进行解决，具体采用哪种方法取决于造成问题的原因。如果原因是膜孔径结构的变化造成，那么只能更换一批孔径结构更加一致的膜来解决。
（1）对膜进行处理：用重新认真挑选的润湿剂预处理NC膜可解决因为膜疏水性和储存不当造成的问题。封闭中添加润湿剂可确保捕获线显色均匀。对膜进行处理可使整卷膜性能更均一，大大提高检测结果的一致性和长期贮存后膜性能的稳定。
（2）膜贮存的最佳条件：建议NC膜的贮存条件相对湿度为40%-60%，湿度20-25℃。这种条件下保存的NC膜在几年内可保持稳定。另外，划线之前在潮湿空气中使膜达到平衡状态会使划线条带更加均一。
（3）优化划线系统：划线系统应具有合适压力、体积以及确保捕获线均一的多种解决方法。
（4）尽量减少蛋白沉淀的发生：如果蛋白配制的缓冲液条件太极端，那么可导致蛋白沉淀析出，这种情况还会导致形成微粒且降低溶液中蛋白的总含量。虽然这种缓冲条件是为确保溶液中蛋白与膜迅速结合，但如果这种蛋白不太稳定那么系统就不能使用。缓冲液配方应着眼于考虑提高蛋白的溶解性（稍微增加溶液中的盐含量，调整溶液H值，或降低沉淀剂的沉淀水平等）。
（5）确保系统组件间合适的联接：系统各组成部分间的联接往往很难衡量，但垫与垫间重叠部分的压力是生产出良好产品的关键因素。如果压力太高，材料会被压碎，孔隙可能会被堵塞。如果连接处压力太小，垫与垫间联接可能很弱。合适的压力大小需要通过试验来确定，垫的不同厚度与相对可压缩性这两个因素都需要进行系统优化。如果系统组件中任何材料发生改变，都需要通过不同检测方法进行重新优化。
总之，蛋白包被（划线）在硝酸纤维素膜上会出现很多问题，但生产出没有非特异性反应、均匀一致的显色试纸条还是可能的。目前基本技术是优化蛋白的吸附，如果在此基础上再精心进行实验设计并控制好每一步实验操作，那么就会获得很好的实验结果。生产中常见的错误是对于不同的蛋白和不同的检测方法都使用相同的实验条件。大多数基于膜的免疫层析快速检测试剂在市场上都是唯一的，最优结果所需的条件也应是不同的，只有对每一种检测方法中蛋白吸附方法的最优化条件进行仔细研究才能获得最好的检测结果。
来源：IVD二十载
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