1.硝酸纤维素膜（NC膜）与蛋白的结合原理
NC膜与蛋白的结合原理并不十分明确，目前公认原理是基于存在的几种作用力，这几种作用力包括疏水作用力、H键、静电作用力等。其结合原理主要有两种假说：两者首先依靠静电作用力相结合，然后依靠H键和疏水作用维持长时间结合；两者首先依靠疏水作用力相结合，然后依靠静电作用力维持长时间结合。两种假说都表明其结合过程分为首先的结合和然后的长时间结合两步进行，但因为其不明确性，所以要生产出质量好的产品还需要根据生产研发实践进行相关技术的改进提高。
2.硝酸纤维素膜的性质对蛋白结合的影响
(1)硝酸纤维素膜的孔径：随着硝酸纤维素膜孔径的逐渐减小，膜的实际可用表面积逐渐增加，膜结合的蛋白量也逐渐增加。用于评估膜表面积的参数通常为膜的表面积比率，实际上也可用膜的表面积与所用膜的平面面积的比率进行评估。另外，膜孔径越小，层析速度也越慢，胶体金标记结合物通过T线的时间也越长，反应也越充分。因此，硝酸纤维素膜的孔径越小，产品的灵敏度越高；同时跑板速度也越慢且发生非特异性结合的概率也越多，即假阳性也越高。必须根据实际试验结果找 到合适平衡点，从而挑选出适合实际产品的硝酸纤维素膜。除此之外，由于测试开始后捕获试剂发生扩散，故而孔径的大小可以影响检测线的外观。在侧向流速高的膜中，蛋白从T线区域开始出现快速弥散，形成更宽更弥散的线。对所有膜而言，结合在膜的深部（10μm以下）的捕获试剂无法产生信号，膜孔径越大，捕获蛋白在膜中的弥散百分比就可能越大。
(2)不同生产厂家的硝酸纤维素用膜的差异：不同生产厂家的硝酸纤维素膜的差异主要来源于以下两点：硝酸纤维素膜的生产过程中使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型、数量不同会对膜性能产生影响；硝酸纤维素膜的处理过程不同也会对膜性能造成影响。
3.喷点（划线）环境
环境湿度对硝酸纤维素膜的溶液喷点（划线）很重要，通常生产环境的最佳湿度为45%～65%,且在溶液喷点前将硝酸纤维素膜放置在该环境中平衡一段时间可确保硝酸纤维素膜湿度的均一性。如果湿度过低，膜上易聚集静电荷使溶液喷点处出现散点导致检测时出现疏水斑。如果湿度过高，会加强膜上的毛细作用导致溶液喷点处的C线或T线变宽甚至扩散。划膜和干燥后，湿度必须保持恒定和低（低于20% RH），直到测试条密封在袋中与干燥剂。干燥后将膜暴露在湿气中会干扰蛋白质的稳定性和功能。
4.硝酸纤维素膜上的溶液喷点（划线）
对于标准的胶体金免疫层析产品，硝酸纤维素膜上至少有一条检测线和一条控制线。目前对硝酸纤维素膜的喷点（划线）方式有两种。一种是接触式膜划线系统，该系统中，喷头划过膜表面同时泵推动一定量捕获试剂释放到膜表面。该系统简易实惠，但因为划线过程与膜表面接触，可能会导致划痕。另外，由于液体进入膜的过程不仅依靠膜表面与喷头的接触，而且与膜吸液能力的一致性有关，这会导致划线线条宽度的变化，使检测结果不一致且系统不能完全定量，同时这种变化也是读数分析时的主要影响因素(读条仪结果与线条宽度相关)。另一种是非接触式喷点系统，如美国BioDot公司的BioJet Quanti 3000系统。BioJet使用电磁阀连接高精度进泵器，捕获试剂喷点到膜上以紧密交叠点构成连续线条，试剂被吸收入膜内从而排除了膜表面与喷头接触的影响。非接触式喷点系统的线条宽度比接触式划线系统更均一。划膜的重要参数包括试剂浓度、分配速率、分配速度和缓冲液，这些都取决于所使用的特定分析试剂和膜。使用接触式划膜仪的典型划膜速率在0.5到1μL/cm之间，这将导致线宽约为1mm。对于中速膜和慢速膜，建议分配率为1μL/cm。快速膜的孔径越大，溶液越能扩散，线越宽，因此需要降低分配率（即0.8μL/cm）才能达到相同的线宽。对于竞争性分析，分配分析物-蛋白偶联物（例如滥用药物-BSA或肽-BSA）在测试线上而不是抗体，分析物和蛋白的偶联物倾向于比抗体溶液更分散，所以分配速率可能需要进一步减小（0.5μL/cm）。对于夹心分析，建议T线和C线抗体浓度的起点为1mg/mL，但范围可以从0.5到2mg/mL。该浓度将取决于灵敏度要求和抗体对样品中分析物的亲和力。重要的是要注意，对于一些竞争性分析，可能有必要在远低于此浓度（例如，0.1 mg/mL）的情况下划线，以达到所需的动态范围。划膜后，重要的是对T线和C线的位置和方向做标记，虽然这看起来微不足道，但它将确保在组装测试条时膜将被放置在正确的方向上。同样重要的是，要在膜上标记出划线可能不一致的地方（断线、不均一），以便识别和丢弃这些条带。
5.溶容液喷点的位置
对于T线的溶液喷点，不同的喷点位置会导致不同的灵敏度。溶液喷点位置上移，胶体金标记结合物通过T 速度变慢造成反应时间增加从而导致检测灵敏度增高。反之，液喷点位置下移，会导致检测灵敏度降低。这种情况也可用于改变产品的灵敏度和消除假阳性。
6.溶液在硝酸纤维素膜上的扩散
一般溶液在硝酸纤维素膜上的喷点量为1μL/cm。 溶液在膜上溶液的扩散趋向两端，干燥时均匀喷点的抗体或者蛋白溶液由于喷点线条边缘干燥速度比中间干燥速度快，中间的抗体或者蛋白会不断向两边扩散，导致干燥后的抗体或者蛋白向喷点线条两端聚集。这种现象一般情况下不影响试验结果， 如果发现线条出现两端颜色较中间深的情况需要考虑上述原因，可以通过添加Tween 20等相关添加剂进行解决。
7.硝酸纤维素膜喷点前后的封闭作用
一般商品化的硝酸纤维素膜都是优化处理好的成品膜，生产中直接进行喷点相关的蛋白等物质就可以了，通常情况下慎用封闭。有些研发人员会在膜喷点前进行膜的封闭，这种方式一定要慎用。因为生产厂家在膜生产时，各种配方是混合加入原浆的，而膜喷点前进行封闭则要将膜浸泡在封闭液内，这必然扰乱成品膜内正常的物质分布从而引发一系列问题。如果生产厂家遇到不进行膜封闭就无法包被物质的情况，应尽量通过其他方法进行解决。常用的解决方法有两种：流动封闭，即将作用物质处理在样品垫上；在膜上进行定点封闭，即将作用物质配成溶液喷点在膜上的特定位置。如果在成品NC膜上又重新进行封闭，那么必然会影响到产品的稳定性，要通过稳定性试验进行评估检测。在膜划线和干燥后应用额外的膜封闭步骤可以帮助改善流动、测试条的稳定性、重现性和阻断与硝化纤维素的非特异性结合。封闭缓冲液可以包括糖、聚合物、蛋白质和/或表面活性剂，虽然有些开发人员可能会使用此步骤，但在优化过程中可能会耗费时间，并且在大规模生产时可能会增加不必要的步骤。大多数硝化纤维素膜是由制造商用专有的溶液处理，以使膜亲水性，封闭膜可能会将这些试剂洗掉，因此任何膜处理都必须仔细评估。另外，用于提高性能的化学物质可以掺入试纸的其他部分，如样品垫、结合垫或运行缓冲液。膜条划线均匀是获得可重复的横向流动结果的关键。
8.生物原料对硝酸纤维素膜上溶液喷点（划线）的影响
对于不同的检测产品，C线或T线的生物原料也各不相同。单克隆抗体与硝酸纤维素膜的结合优于多克隆抗体，因为多克隆抗体有很多不同表面结合位点，并且各结合位点与膜的最佳结合条件也不尽相同，所以增加了产品优化的难度；单克隆抗体的制造风险较低，并且批次间更可控，因此更受欢迎，但在某些情况下，多克隆抗体可能提供最佳的灵敏度，因为它们能够结合分析物的多个位点；用抗原特异性柱亲和纯化的多克隆抗体与粗多克隆抗体相比，在应用中有更好的特异性。如果一个检测的配对是单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体通常更倾向于与纳米颗粒结合，因为它们通常对抗原具有高特异性，并且它们不太可能通过待测物质的介导形成标记物颗粒之间的交联聚集，多克隆抗体具有高亲和力和识别多个表位的能力，因此在测试线上首选多克隆抗体。IgA或IgM由于其结构或空间上的潜在问题，优化的难度可能更大；除抗体以外的捕获蛋白，由于其化学性质或分子量大小异质性很大，优化的困难更大。一般说来，分子量越大的蛋白质与表面的结合越牢固。选择抗体时需要考虑的因素包括成本、可获得性、敏感性、特异性、动力学、交叉反应性和抗体类型（单克隆或多克隆），通常在第一轮筛选中，应尽可能测试更多的抗体，以确定最有效的抗体配对。
传统的筛选方法，如在微孔板ELISA、磁微粒化学发光、Western Blot上筛选的抗体配对可能无法满足在免疫层析上的要求，因为抗体在横向流动中的动力学表现完全不同。在横向流动中，抗体在与纳米颗粒偶联后必须保持活性，在完全干燥时保持其结构完整性，并在样品再水化时立即反应。另一个区别是，传统的筛选方法通常具有较长的孵育时间，而横向流动与检测线的结合必须在几秒钟内发生，由于接触时间很短，抗体在侧流中的结合动力学对测试结果的影响较大。由于抗体的位阻和结合能力，作为捕获抗体不好用的抗体用于标记可能好用，捕获抗体和标记抗体配对调换使用可能会取得完全不同的结果。因此当选择合适的抗体对进行夹心分析时，应测试每一种可能的捕获抗体和偶联抗体的组合，例如，筛选4个单克隆抗体将产生12种可能的抗体配对组合。此外，通过被动吸附制备的标记物可能与通过共价方法制备的标记物表现不同。在完成抗体选择之前，进行交叉反应性实验以确保所选抗体不会识别临床样品中存在的其他分析物是很重要的，因为对所选抗体进行横向流动试验的后续优化需要进行大量工作，应在开发过程中尽早评估潜在的交叉反应性。
9.捕获试剂缓冲液对硝酸纤维素膜上活材喷点（划线）的影响
捕获缓冲液对最终结果有明显的影响。合适的缓冲液必需能够溶解捕获蛋白以达到应用所需浓度，并能保持稳定。要获得最佳的结合意味着创造利于蛋白分散于固相的最佳条件。随着捕获蛋白不同，蛋白与膜结合的优化条件也有所不同。缓冲液中的捕获蛋白需要达到合适的浓度，如果浓度过低，将无法在捕获线处捕获足够的蛋白，蛋白若形成沉淀，将阻碍膜上的孔隙从而导致样品经过测试条的测试区域时出现不规则的流动。沉淀也可能阻塞仪器管道和孔洞从而损坏仪器装置。pH值和离子浓度是需要进行优化的两个重要参数。一个性能优良的缓冲液配方对于生产出高质量的产品来说至关重要，基于这种实际情况下面提供一些缓冲液配方方面的基本思路以供参考。
pH水平：缓冲液中pH水平在很大程度上会影响蛋白与膜的结合。由于NC膜无酸性质子，因此调节pH时改变的是蛋白的性质。蛋白质的溶解度在其等电点（pI）时最小，过大或过小的pH值可使蛋白发生变性，使其结合特性发生巨大改变，甚至产生聚集及析出沉淀。综上原则，在探索使蛋白溶液能在固相中理想分布的条件时，最理想的缓冲液条件是pH值等于或接近捕获蛋白pI的时候。常用的缓冲系统有磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐和Tris盐缓冲液。值得注意的是，侧向流检测应用时捕获分子在膜上需被干燥，这意味着缓冲液所有组分，除可挥发成分外，都需在膜上干燥。这就使得可挥发的缓冲液如醋酸铵或碳酸铵特别受青睐。高浓度的伯铵（例如来自Tris缓冲液）可导致捕获蛋白中酸性氨基酸残基（谷氨酸、天冬氨酸）与缓冲离子氨基间形成盐桥，从而遮盖住结合位点，因此不建议使用。
离子浓度：电解质溶液中离子的解离可降低蛋白-蛋白之间的相互作用力，因此在特定离子浓度范围内溶液中蛋白溶解度显著增强（盐溶效应）。而过高离子强度则相反（盐析效应）。这是因为此时大量的溶解离子占据越来越多的水分子，导致蛋白分子周围溶解层塌陷，蛋白分子相互作用，从而形成聚集和沉淀。根据这一原则，蛋白应在应用缓冲液中进行溶解，同时还应使其保持在利于膜固相分布的环境中。利用盐析效应可以合理的降低溶液中分子的稳定性。然而，某些盐如硫酸铵能使蛋白溶液稳定化降低，控制的难度也有所上升。盐浓度的小的变化（如蒸发导致的）会严重影响沉淀的程度。除此之外，使用这些类型的缓冲液干燥后还会将大量的盐引进膜系统中，从而严重干扰整个测试。最大众的意见是使缓冲液中的离子强度尽可能地低，以减少盐溶效应，通常不被推荐添加氯化钠。
缓冲液的配方组成一般是：PB(其他缓冲体系)+添加剂或作用物质(针对某一特定问题)+pH值调整，推荐的缓冲液体系为0.01M PBS PH值7-7.2,该pH 缓冲液体系对多种抗原或抗体都有良好的适应性。配方原则上宜简不宜繁，应根据实验实际需要添加相应添加剂或作用物质， 并且需要注意的是，随着硝酸纤维素膜的生产制造技术的不断改进提高， 以前需要添加添加剂或作用物质的实验有很多都不再需要添加了。另外，关于实验中的添加剂或作用物质有下面这些：少量NaCl可减少信号强度、消除假阳性；有机醇(甲醇、异丙醇等)可润湿硝酸纤维素膜，减少膜上所带的静电荷，更有利于硝酸纤维素膜与蛋白的包被结合(如果因为制膜工艺改进则不用添加); 避免显色线条出现中空现象也可增表面活性剂(Tween20,TX100) ；糖类可作为保护剂，减缓产品老化速度，也可增加亲水力。 最后，调整pH值到某个位置置也可消除假阳性。
共沉淀剂：为了改进所用的缓冲液，研发人员可选择添加去稳定剂和共沉淀剂以降低溶液中蛋白分子的稳定度，促使其与固相表面的结合。其中，抗体Fc区域的结构特性使其更容易在共沉淀剂作用下发生变性。Fc区域的部分不稳定性可导致许多正常状态下隐藏于蛋白结构内的疏水基团暴露。因此，无论蛋白与硝酸纤维素膜的结合是基于何种机制，使用共沉淀剂，增加蛋白疏水性有利于蛋白的结合。使用最为广泛的共沉淀剂是醇类（经典的有甲醇、乙醇或异丙醇），其优势体现在多个方面。首先，醇类有助于膜的重湿润，降低膜可能带有的静电，还能破坏溶液中蛋白质的稳定性。其次，它可降低溶液的粘度及表面张力，从而促进蛋白扩散进入膜中。另外，它也可以加速干燥过程。3-5%浓度范围的甲醇可以显著改善膜在免疫试验中的性能。
来源：IVD二十载
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