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一、抗体的结构与作用

抗体是免疫系统的重要组成部分，主要分为IgM、IgA、IgD、IgG和IgE，除单链抗体外，所有抗体都遵循相同的基本结构：两个完全相同的重链和两个完全相同轻链通过二硫键组成对称结构，N端为可变区，搭配三到四个恒定区（CH1-CH4），形成完整的分子。传统的示意图一般认为抗体呈Y型，如下图：

免疫球蛋白作为免疫防御系统的核心分子，具有多种关键功能。

1.免疫防御：免疫球蛋白结构特征与抗原识别机制高度契合，能够精准响应机体的免疫防御需求。当抗原刺激时，B细胞会启动亲和力成熟、类别转换及分化等程序，最终形成分泌抗体的浆细胞，初始为IgM型，根据刺激源（如病原体）和感染部位的不同，可转化为IgG、IgA或IgE型。利用抗体的中和作用使病原体失去感染能力。

2.免疫细胞激活：为了将病原在宿主体内清除，抗体的Fab片段和抗原特异结合后，宿主的免疫细胞表面Fc受体（Fc fragment receptor, FcR）就会识别该抗体的Fc片段并与之结合，激活免疫细胞，活化的免疫细胞可以通过抗体介导的吞噬作用、抗体介导的细胞杀伤作用等机制，清除病原微生物，如下图：

3.补体激活：补体系统是广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面的一组精密调控的蛋白质反应系统，包括30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白。免疫球蛋白与病原体或异常细胞结合后，C1/C1q分子（经典补体途径的第一组分）迅速与临近的免疫球蛋白结合，激活补体系统，最终形成膜攻击复合物，将靶细胞溶解，如下图：

二、抗体结构的逻辑悖论与解释

血液中的免疫球蛋白与大量补体C1分子，以及携带细胞表面Fc受体的免疫细胞并存；此外，类风湿因子（RF）属于自身抗体，它们能与IgG结合已被广泛证实。然而，RF、C1/C1q分子和细胞表面Fc受体与血液中的免疫球蛋白之间并未发生强烈相互作用，这看似存在一个逻辑悖论。

如何解释这个逻辑悖论？研究揭示了一个有趣现象：传统理论认为Ig(G)结构呈现“开放”构象（图A,B），但实际上天然Ig(G)采用“闭合”形态（图C,D），其重链会向内折叠形成环状结构。这一发现不仅破解了上述表面矛盾，更生动展现了免疫球蛋白/抗体这种生物体的精妙自然设计。

有人说在电子显微镜下看到了抗体的结构是Y字形，而不是所谓的M型，如下图，实际上，在进行电子显微镜观察前的预处理步骤，吸附在固相表面上的抗体，其大部分结构已经不可避免地呈现开放构象，也就是说我们在电子显微镜下观察到的抗体分子结构可能已经不是天然构象了。

研究认为，RF、C1/C1q、FcR的结合表位可能都位于IgG的Fc部分CH2/CH3沟槽或CH3/CH3沟槽。天然状态下其结合位点被Fab所遮蔽，因此在血液循环中并不会与抗体发生反应。但是如下几种情况可以让天然抗体分子的构象发生变化，从而暴露出结合表位。

l抗体经特定物理化学处理（如57℃热处理）：类风湿因子检测试剂所使用的抗原是变性的人或动物IgG抗体，因为变性抗体才能与类风湿因子产生更强的免疫反应。将初步纯化后的IgG 溶液（浓度控制在 1 - 5mg/mL）置于 56 - 63℃的水浴环境中，温育30 - 60 分钟。热作用可破坏 IgG 分子内的氢键和二硫键，致使其空间结构变得松散，原本隐藏在分子内部的与 RF 结合的 Fc 段抗原表位得以暴露。

l抗体物理吸附于疏水表面：被动吸附技术因其在抗体分子固定化应用中的重要性而备受关注，主要涉及将抗体分子固定于微孔板（聚苯乙烯）或微球（乳胶/磁珠）等载体表面。蛋白质吸附到疏水性颗粒的过程，是通过非极性或芳香族氨基酸残基与颗粒表面聚合物的强相互作用实现的。由于蛋白质通常具有疏水核心结构且表面以亲水性为主，它们与疏水性颗粒的相互作用必然涉及显著的构象变化，从而形成大规模疏水接触。这种构象变化往往会导致最先吸附到颗粒上的蛋白质层完全变性。虽然自1956年布尔研究白蛋白在玻璃表面的吸附现象以来，人们已知蛋白质被动吸附会导致变性效应，但直到后续多项研究发表后，这一危害性才被广泛认知。疏水表面被动吸附对生物分子的有害影响可能非常显著。Butler等人（1993年）研究发现，超过90%的单克隆抗体和约75%的荧光素多克隆抗体在吸附到聚苯乙烯表面后会发生变性。

l抗体与抗原结合：抗体（免疫球蛋白）与抗原的结合是免疫系统识别和清除病原体的关键步骤，但这种结合并非“静态匹配”，而是会触发抗体分子的构象调整，进一步优化与抗原的结合亲和力，同时激活后续效应功能（如补体激活、Fc 受体结合） 。抗原与抗体可变区（尤其是互补决定区 CDR）结合时，先通过初步的静电作用、疏水作用形成弱相互作用，随后抗体 CDR 区的氨基酸侧链或主链发生局部折叠 / 伸展，形成与抗原表位更互补的构象，从而增强结合亲和力。抗体的铰链区具有高度灵活性，抗原结合后可通过铰链区的构象变化调整两个Fab 段的空间角度，从而适应抗原表面的多表位分布，实现 “双价结合”。构象变化可通过铰链区传递至 Fc 段，改变 Fc 段的空间结构，使其能与补体成分（如 C1q）或 Fc 受体（如 FcγR）结合，启动补体激活、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）等效应功能，这种变化是抗体 “识别 效应” 偶联的关键环节。

三、类风湿因子的干扰与消除

类风湿因子（RF）对免疫检测的干扰已被广泛熟知，主要体现在两个方面，一是间接法检测IgM抗体容易导致假阳性；二是类似于异嗜性抗体对捕获和标记抗体有非特异性结合。

间接法检测IgM抗体，免疫荧光法、ELISA、化学发光法均会受到干扰。固相包被的是抗原，样本中既有IgM抗体也有IgG抗体，在没有特异性IgM抗体存在的情况下，IgG抗体会与固相抗原反应，然后IgG抗体的构象发生变化，暴漏出RF结合位点，RF是IgM型的自身抗体，就会与已经构象变化的IgG抗体结合，随后抗人IgM二抗与RF结合，导致假阳性。已有研究证实样本中没有特异性IgG抗体存在时，即使后RF存在，也不会出现假阳性。因此消除假阳性的方法就是去除样本中的所有IgG抗体，常用的方法是在试剂组分中添加抗人IgG多抗或抗血清，最彻底的消除方法是待抗人IgG多抗与样本反应形成沉淀后，离心将沉淀去除，取上清进行检测。

类风湿因子与异嗜性抗体存在诸多相似特征，已有研究指出二者可能具有共同的免疫学起源。这类抗自身抗体在普通人群中检出率约为5%-10%，而在类风湿关节炎患者中占比高达70%。由于人类抗体与多种动物抗体的Fc结构域具有高度同源性，其与动物抗体产生交叉反应的情况很常见。在这些情况下，类风湿因子导致的假阳性的原理就与异嗜性抗体类似。要消除这种干扰就需要在试剂组分中添加被动和主动阻断剂，在“免疫检测中异嗜性抗体干扰”部分的内容中已经有阐述。

四、补体的干扰与消除

补体的干扰在免疫检测中也很常见，如果发现新鲜采集的血清样本检测信号值异常偏低，第二天复测结果又正常了，那大概率是受到了补体的干扰，因为补体很不稳定，容易失活。前面已经讲过，当抗体与抗原结合后、抗体固相化之后，都会导致抗体构象发生变化，从而暴露补体C1q的结合位点，随后发生级联反应，生成膜攻击复合物（MAC），MAC的分子质量约为1.67×10³ kDa，空间直径 15-20 nm，其位阻效应就抑制了该抗体与待测物质的结合。

因此在用抗原检测抗体的产品上就很容易出现补体的干扰，例如用间接法检测病原体的IgM抗体，用双抗原夹心法检测梅毒等病原体抗体。尤其是用固相抗原检测IgM抗体，因为IgM抗体是五聚体，激活补体的效率更高。当样本中的待测抗体与固相抗原结合后，抗体构象变化激活补体，形成大分子量的MAC，通过位阻效应抑制了标记活材与待测抗体的结合（下图补体干扰模式1）。

双抗体夹心法检测抗原的产品受到补体干扰的情况有所不同，是捕获抗体包被到固相上之后构象发生变化，暴露了补体结合位点，而不是固相抗体与待测抗原结合之后导致的构象变化激活了补体。受干扰的程度与固相抗体的性质有关，不同的抗体激活补体的能力有差异，且不同抗体固相之后，补体结合位点暴露的程度也有差异。因此就会出现有些产品受补体干扰大，有些产品似乎不受干扰（下图补体干扰模式2）。

因此在产品设计时都应该考虑预防性的消除补体干扰，常用的方法是在试剂组分中添加金属离子螯合剂，因为补体的激活需要钙离子。是否还有其他更有效且可方便实施的方案也欢迎讨论。

[1] Maibom-Thomsen S L , Trier N H , Holm B E ,et al.Immunoglobulin G structure and rheumatoid factor epitopes[J].PLoS ONE, 2019, 14(6):e0217624.

来源：IVD二十载

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