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免疫分析技术自问世以来，历经六十余年不断发展完善，已成为体外诊断中最重要和市场份额最大的检测技术。使用动物抗体检测抗原仍是该方法的核心原理，一旦样本中存在任何能与动物抗体结合的物质，就会引发问题。早在20世纪70年代初，就有文献报道人血清样本中存在抗动物抗体导致检测结果异常，单克隆抗体应用到免疫检测中后，又有多篇文献报道了人抗鼠抗体导致的干扰。到目前为止，免疫检测易受人血清（甚至分泌物）样本中抗其他种属动物抗体的干扰，已被行业广泛熟知。医院检验科的实验室人员应对实验室结果与临床表现不符的情况保持质疑态度，熟悉所开展检测方法易受干扰的特性，必要时可设计试验对异常结果进行验证，查找原因。免疫检测产品的研发设计人员，应投入必要资源采取针对性防护措施，尽量减少这种异嗜性抗体的干扰。本文综述了异嗜性抗体的性质、干扰模型、干扰识别方法、干扰消除方法。

异嗜性抗体（heterophilic antibody）是什么？

在日常实验中，当我们怀疑患者样本中含有通过结合检测和捕获抗体导致免疫测定假阳性的抗体时，通常会使用“异嗜性”或“异嗜性抗体”这一术语。这些干扰抗体对免疫检测的影响可能非常相似，传统上它们被分为三大主要类别。

人抗动物抗体（Human anti-animal antibody）：已知的抗原暴露

“人源抗动物抗体”这一术语应专指因注射动物抗体用于诊断或治疗而产生的人体抗体。其中，人源抗小鼠抗体（HAMA）尤其值得关注，因为临床医学和免疫检测中使用的绝大多数抗体都源自小鼠。这类抗体可能引发严重的问题，因其浓度高且亲和力强。人源抗动物抗体在临床检测中极少遇到。然而，随着小鼠抗体被更多用于患者诊断和治疗，它们的频率和特性可能会发生变化。

异嗜性抗体（Heterophilic antibody）：未知的抗原暴露

临床实践中发现的大多数与动物抗体存在亲和力的干扰性抗体，患者往往没有明确接触过动物抗体，包括抗体治疗、被动物撕咬、甚至是饲养动物，这类抗体被称为异嗜性抗体。人血清中的抗体与动物抗体存在亲和力的情况非常普遍，据报道高达40%的人群中存在此类抗体，但其中大部分不会对免疫检测造成影响。异嗜性抗体通常被认为是低亲和力且具有广泛特异性的抗体，但也存在例外情况，我们遇到的几种异嗜性抗体对小鼠IgG1抗体的Fc区表现出高亲和力，但对F（ab）2片段、其他同型小鼠抗体或其他动物抗体几乎或完全没有亲和力。

与捕获或标记抗体交叉反应的类风湿因子

类风湿因子属于自身抗体，这类抗体（通常为IgM型）能特异性识别患者自身IgG抗体的Fc结构域。这类抗自身抗体在普通人群中检出率约为5%-10%，而在类风湿关节炎患者中占比高达70%。由于人类抗体与多种动物抗体的Fc结构域具有高度同源性，其与动物抗体产生交叉反应的情况很常见。类风湿因子与异嗜性抗体存在诸多相似特征，已有研究指出二者可能具有共同的免疫学起源。传统观点认为类风湿因子是低亲和力、广谱特异性的抗体，但这一规律也存在例外情况，有些类风湿因子导致的假阳性也非常强。

异嗜性抗体干扰的干扰模式有哪些？

什么时候应该怀疑存在异嗜性抗体干扰？

当实验室检测结果出现异常或与临床表现不一致时，必须考虑干扰因素。以下几种情况需要特别注意，在这些情况下，需将嗜异性抗体视为免疫测定中潜在的干扰来源。

在免疫测定中曾出现假性或可疑结果的患者：商品化免疫检测中使用的抗体通常为小鼠单克隆IgG1型，多数来源于近交的Balb/C品系。这些抗体的恒定区（包括Fc区域）高度相似。由于大多数问题性异嗜性抗体会靶向检测抗体的Fc区域，因此在某次检测中出现假阳性结果的患者，在其他检测中再次出现假阳性的概率相对较高。

既往暴露于动物抗体的患者：接受未经修饰的小鼠单克隆抗体注射（用于治疗或诊断）的患者，可能会产生干扰抗体。采用嵌合抗体（将小鼠Fc区替换为人源Fc区），或经过人源化改造（超过95%的小鼠序列被人类序列替代）治疗，尽管患者产生抗小鼠抗体的风险较低，但随着这类患者数量不断增加，预计部分患者仍可能产生可干扰的抗体。

血清类风湿因子阳性患者：类风湿因子很常见，虽然在大多数情况下不会干扰免疫分析，但相对而言，但类风湿因子患者中比一般人群更容易出现干扰。越来越多的风湿病患者接受嵌合或人源化小鼠抗体治疗。这些患者患有慢性疾病，通常具有复杂的临床表现，随着时间的推移往往会产生大量的实验室检查，进一步增加了产生错误结果的可能性。

如何确认免疫检测受到了异嗜性抗体干扰？

l采用不同的免疫分析或替代方法进行重新分析：最常用的方法，虽然不同厂家方法可能都受到干扰，但是这种概率较低。

l稀释样本：一般认为非特异性吸附导致的干扰通过稀释后检测结果会呈非线性，但这种方法有局限性，有些异嗜性抗体干扰稀释也呈线性反应；还有一些正常待测物质稀释不呈线性关系，反而错误以为是干扰样本。

l阻断试验：在复检前向样本中添加无关动物免疫球蛋白。若患者样本中含有会与小鼠IgG1检测抗体交联的异嗜性抗体，向样本中添加小鼠IgG1抗体即可中和这些异嗜性抗体，避免干扰。在使用多克隆兔或山羊抗体的检测中，应向样本中添加多克隆兔或山羊IgG，但与单克隆抗体（0.1-0.2 mg/mL）相比，通常需要更高浓度的多克隆抗体（0.5-1 mg/mL）才能实现有效的封闭效果。添加经热处理或化学聚合形成的聚集抗体，其阻断效力都优于未聚集的抗体，因为抗体聚集体能与异嗜性抗体形成更稳定的复合物。例如，若某异嗜性抗体对小鼠抗体的Fc区段具有高亲和力，那么大量Fc区段紧密排列的小鼠抗体聚集体就会成为该异嗜性抗体的首选靶标。当免疫测定实验中同时使用两种物种的抗体时（例如小鼠单克隆抗体作为固相抗体，兔或山羊多克隆抗体作为示踪抗体），阻断实验往往较为困难。此时使用与标记抗体类似的聚集型抗体进行阻断效果最佳，因为通常干扰样本往往会出现异常升高的结果，这是由于样本中含有对示踪抗体具有亲和力的异嗜性抗体，导致实际结合的标记抗体量过高所致。但是若怀疑存在干扰导致的假阴性或结果偏低，使用与固相抗体同种/型的阻断抗体可能是最佳选择。 通常会让样本与阻断剂孵育10-15分钟，以确保异嗜性抗体能完全结合到阻断抗体聚集体上。

l去掉样本中的抗体：异嗜性抗体也是人抗体，将样本中的人抗体全部去掉，也就去掉了干扰抗体。常用的方法有硫酸铵或聚乙二醇沉淀抗体；Protein G或Protein A亲和吸附抗体；尺寸排阻法过滤抗体。

l去掉试剂中的抗原组分：有一种检测病原体IgM抗体的方法，固相的捕获抗体是抗人IgM抗体，通过抗原组分与捕获的IgM抗体反应，然后加入针对抗原的标记单克隆抗体形成夹心复合物。该方法的固相二抗可以捕获人样本中的所有类型IgM抗体，包括类风湿因子RF，不同于常规的双抗体夹心法，干扰抗体需要同时与固相抗体和标记抗体反应才能出现假阳性，这种IgM型的异嗜性抗体已经被固相抗体捕获，只需与标记抗体结合就能导致假阳性，因此出现假阳性的概率远高于普通的双抗体夹心法。识别这种干扰类型也非常简单，只需在检测中去掉抗原组分，以稀释液替代，如果检测结果仍旧异常，可以认为存在异嗜性抗体的干扰。

l异嗜性抗体检测：专门设计一个检测方法，固相抗体和标记抗体使用针对不相关蛋白的抗体，最好是使用与免疫检测方法相同种属和亚型的抗体，比如固相抗体用针对CEA的小鼠单克隆抗体IgG1亚型，标记抗体用针对AFP的小鼠单克隆抗体IgG1亚型。或者固相载体上使用抗HCG小鼠单克隆IgG1，标记抗体使用兔或羊抗HBsAg多克隆抗体。或者固相抗体使用鼠抗人IgM抗体二抗，标记抗体使用试剂盒中的结合物抗体或其他抗体。如果检测结果中出现了异常偏高的检测结果，可以认为此样本中含有异嗜性抗体，当然，如果没有检测到异常结果，也不排除所建立的检测方法仍无法检测到干扰抗体。通过进一步改良干扰检测法，可以开发出能够定量检测HAMA的方法，目前市面上已有类似的商业化检测方案，用于监测接受小鼠抗体或其衍生物治疗的患者。

如何设计检测方法，最大限度的避免干扰？

在免疫检测领域，异嗜性抗体干扰始终是实验室面临的一大挑战。由于人源抗体存在无穷变化且亲和力难以预测，因此永远无法开发出完全不受干扰的检测方法。不过，通过采用具有足够特异性的检测方案，可以有效降低干扰发生率。在检测试剂盒开发过程中，制造商必须采取具体措施来提升试剂的抗干扰能力，并将其作为研发过程中的优先事项。以下是制造商为降低干扰需要考虑采取的方案：

使用抗体片段而不是整分子：大多数免疫测定方法都采用小鼠单克隆抗体进行设计，通常选用IgG1亚型。这意味着固相抗体与示踪抗体很可能具有共同的表位，从而增加了患者样本中存在能够交联抗体的物质的可能性。由于多数干扰性抗体会靶向检测抗体的Fc端结构域，因此去除Fc端可能是最关键的防护措施。一些商业免疫检测方法采用F(ab)2或Fab片段进行设计，对抗体进行酶切和纯化处理，过程中可能会有20%-30%的抗体损耗。另外重组单链抗体（scFv）对异源抗体的耐受性更为优异，不过开发高亲和力单链抗体的难度较大，生产成本较高。

捕获和标记抗体使用不同种属的抗体：通常采用小鼠单克隆抗体作为捕获抗体，而兔或羊抗体作为标记抗体，由于固相抗体与示踪抗体较少存在共同表位，这类检测方法相比使用同种单克隆抗体的检测法，更能有效避免异嗜性抗体干扰。但需注意，有些干扰抗体并非同时与固相抗体和标记抗体形成交联才产生假阳性结果，而是只与标记抗体具有亲和力，这类异嗜性抗体会在捕获抗体-抗原-标记抗体形成的“三明治”结构基础上捕获更多标记抗体，从而导致信号强度虚高。

使用纯度更高的抗体：产生抗体的杂交瘤通常在含有动物血清的培养基中生长，主要是胎牛血清。因此如果纯化方案未对小鼠与牛源抗体进行分离，可能导致小鼠单克隆抗体携带高达10%的牛源免疫球蛋白。在含有受污染小鼠抗体的检测体系中，固相抗体和标记抗体可能同时存在牛源免疫球蛋白，普通人群中普遍存在对牛源抗体具有亲和力的内源性抗体，这可能与日常食用牛肉及乳制品有关，因此受牛源免疫球蛋白污染的检测体系特别容易受到干扰，可以在检测系统中添加牛抗体来消除干扰。另外使用无血清细胞培养基制备抗体可以避免这个问题，尽管成本会更高一些。

试剂组分中添加阻断剂：在检测试剂的标记物稀释液、样本稀释液中添加阻断剂是最常用也是最有效的方案。阻断剂就是各种动物血清或抗体，分为被动阻断剂和主动阻断剂。被动阻断剂一般与检测试剂中捕获抗体或标记抗体的种属和亚型一致，可以是血清，也可以是纯化的血清抗体或者单克隆抗体。样本中的异嗜性抗体本来会与捕获抗体或标记抗体结合，但加入大量阻断剂后，异嗜性抗体首先与阻断剂结合被消耗，因此无法形成干扰。若检测试剂的标记抗体是单克隆抗体，阻断剂一般添加0.1-0.2 mg/mL，若检测试剂的标记抗体是多克隆抗体，通常需要更高浓度的阻断剂（0.5-1 mg/mL）才能实现有效的封闭效果。主动阻断剂主要针对IgM型的类风湿因子，可以主动和异嗜性抗体结合，猜测结合位点位于抗体的CH1/CH2，结合后形成的复合物封闭了异嗜性抗体的Fab结合位点，阻断异嗜性抗体对捕获和标记抗体的结合，主动阻断剂的添加量一般会少于被动阻断剂。不管是主动阻断剂还是被动阻断剂，添加经热处理或化学聚合形成的聚集阻断剂抗体，其阻断效力都优于未聚集的抗体，因为抗体聚集体能与异嗜性抗体形成更稳定的复合物。

被动阻断剂和主动阻断剂消除干扰的模式

来源：IVD二十载

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