结合垫用于承载标记物，保证结合物的稳定，并且能够有效、快速、均匀释放标记物。结合垫的材质有玻璃纤维、聚酯膜、无纺布（人造纤维）等惰性介质，不同的毛细管流动特性使标记物释放的速度不同，事实上结合垫上标记物的释放速度很大程度上取决于结合垫的材质。结合垫应经过预处理以确保合适的释放速度和良好的稳定性。结合垫本身的材质、厚度和预处理的过程会对结合物的承载量、释放速度、释放残留度、均一性、稳定性、结合物喷涂的宽度等产生影响。例如，结合垫的厚度如果偏薄、纤维丝太稀疏，或者厚度不均匀，喷涂结合物时容易喷透结合垫至台面上，或者喷涂太宽、边缘不整齐，导致结合物喷涂不均匀，影响精密性。结合垫的纤维丝如果太密，可能会导致结合物释放的残留，尤其是粒径偏大的荧光微球和彩色乳胶微球。结合垫预处理液的配方不合适，会导致结合物的释放过快或过慢，有边缘效应，影响灵敏度和精密性。通过增加标记物粒子的数量和允许更长的抗体和分析物在样品中的孵育时间（较慢的释放速度或流速）可以提高灵敏度，为每个产品筛选尽可能多的材料以确定最有效的材料对于特定的产品设计是很重要的。
结合垫可以执行多种任务，其中最重要的是将标记物粒子和样品以恒定的体积均匀转移到膜上。当样品流入结合垫时，标记物粒子溶解，脱离垫材，随样品前端进入膜中。最终，释放检测物粒子进入样品流所需的样品体积决定了可以测量的分析物量。即测试条中实际检测到的样本量等于溶解检测物粒子所需的样本量，而不是试剂条吸收的总样本量。只有那些先于或与检测物粒子一同迁移的样品中的分析物才能对信号做出贡献。进入结合垫和膜的样本量，如果不能将检测物粒子完全释放，信号产生强度将会受到影响。也就是只有样本将标记物粒子完全溶解释放才能发挥试剂最优性能。
理想的结合垫材料应具备以下特性：
1）低非特异性结合。如果标记物粒子或分析物与结合垫垫结合，将无法在检测线上形成免疫复合物，从而降低信号强度和灵敏度。
2）一致的流动特性。不一致的流动性质可能导致严重的性能问题，如果材料未能均匀地将样品层流到膜上，标记物粒子可能会随着样品沿膜迁移而形成条纹。因此，在测试线和对照线上会出现信号不均的情况。
3）床体积一致。当通过浸入法将标记物粒子涂到结合垫中时，每个试纸条中的标记物粒子数量取决于材料的床体积。如果床体积有显著变化，则即使试纸条的所有其他成分保持不变，也可能观察到信号强度的变化。
4）低溶出物。除了化学浸出物外，材料还不应含可能在结合垫/膜界面处堵塞膜的颗粒。
5）良好的处理特性和一致的可压缩性。这些属性对于试纸制造和将液体均一转移到膜上非常重要。
在分配/喷涂结合物之前，可能需要对结合垫进行预处理，预处理组分通常包括用于pH调节的缓冲液，但不应含有高浓度的盐，因为这可能使标记物粒子凝集。蛋白质、聚合物和洗涤剂可以添加到结合垫预处理中，以帮助标记物粒子的释放和均匀的流动。在进行测试时，这些组分比标记物粒子向上移动的速度更快，并且可以在与标记物粒子相互作用之前封闭膜，这减少了非特异性的相互作用。有时候为了简化制造，在结合物复溶液中加入封闭试剂和非离子表面活性剂可以替代预处理垫封闭膜的作用（实际上不建议复溶液中含有过多表面活性剂）。结合垫处理可以通过浸泡或通过喷涂进行，物料应在37℃的强制空气对流烘箱中干燥1-2小时，然后在18-25℃的干燥环境（相对湿度<20%）中固化保存。
结合垫处理液中的化学物质有一个重要的方面通常被忽视，这些化学物质是通过施加溶液并蒸发水分来加载到垫中的。由于处理液中添加物有不同的溶解度，溶质在蒸发过程中可能会变得非常不均匀。像吐温20这样的液体成分会恢复到高度浓缩的状态，并且可能不会均匀分布在结合垫的纤维网络中。当样品施加到测试条上时，结合垫上干燥的物质溶解速率将取决于它们的固有溶解度以及分子界面处的混合速率。可以预期，当样品施加到测试条上时，这些成分不会以相同的速率重新溶解。因此，溶解较快的成分会在液流前沿更加集中，而溶解较慢的成分则会延迟释放到液流中。这些现象的效应是在液体流通过结合垫并进入膜时，在液体流中产生一组化学浓度梯度。在液体流中，可能有某些位置的化学物质浓度不利于抗体和分析物之间的相互作用。
1. 结合垫材质
常用的结合垫材料包括玻璃纤维、纤维素以及表面亲水处理过的聚酯或聚丙烯。结合垫与膜一样，对侧向流动试验的性能至关重要，材料性质将决定可以吸收的偶联物的体积以及释放的速度。
结合垫材料供应商有密理博Millipore，MDI，Ahlstrom（奥斯龙）、上海杰一、通晟纸业等，以下是部分试验的样品。
编号 | 材质 | 规格型号 | 供应商 | 生产厂家 |
1 | 玻纤 | 8951 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
2 | 玻纤 | 8950 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
3 | 玻纤 | 8980 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
4 | 玻纤 | 8880 | 通晟纸业 | 通晟纸业 |
5 | 玻纤 | 8975 | 通晟纸业 | 通晟纸业 |
6 | 聚酯膜 | 6613 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
7 | 聚酯膜 | 6614 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
8 | 聚酯膜 | 0800 | 上海杰一 | 杰一 |
9 | 聚酯膜 | 6608 | 通晟纸业 | 通晟纸业 |
10 | 聚酯膜 | 6615 | 上海杰一 | 奥斯龙 |
奥斯龙8950是一种相对低密度的玻璃纤维，当标记物需要快速释放时是一种很好的起始材料，快速释放通常有利于竞争性分析和粘性样品介质（如唾液）。奥斯龙8980和Millipore GFDX是更致密的玻璃纤维材料，可以容纳相对较大的偶联物体积，释放速度较慢。8980和6614是奥斯龙新一代的结合垫材质，具有改善均匀性，更高的性能一致性。6614是一种新型的亲水性聚酯材料，可以更快的进行预处理，更容易分配/喷涂标记物。从下图可以看出6614更加致密，8980虽然没有6614致密，但是纤维也比较均匀，6613厚薄不均很明显。
2. 标记物喷涂到不同结合垫材质上的外观
标记物喷涂在结合垫上的线条宽度，均一性与结合垫的材质、结合垫的处理液配方、喷涂压力和高度相关。但是材质起到了决定性作用，有些材质使用不同的结合垫处理液处理，喷涂出来仍旧是均一状态，但是有些材质例如6613，不用处理液处理喷涂出来很均匀不扩散，但是处理后喷涂出来就很不均匀。虽然处理液配方有一定影响，比如表面活性剂降低表面张力，有利于喷涂的结合物在结合垫扩散的更远，但是影响有限。喷涂压力大喷出来的线条相对较窄，但是可能由于压力太大而结合垫被喷透，导致精密性变差。标记物喷涂在不同的结合垫上（2.7ul/cm）的外观如下。
6614结合垫：材质厚，纤维丝密，均匀，结合物喷上后不易扩散，且不易喷透
6613结合垫：材质薄，纤维丝相对稀疏，不均匀，喷涂上后易扩散，易喷涂透。正面和反面的纤维丝的走向不同，背面喷涂出来是更不规则的宽带。
8880结合垫：材质厚，纤维丝密，均匀，结合物喷上后不易扩散，不易喷透。
其他几种常见的结合垫喷涂外观如下：
结合垫处理配方：Tris-HCl(8.0)+2%蔗糖+0.3%Casein+0.1%吐温20
3. 结合物释放
以下是本实验的结果，仅供参考
3.1 胶体金层析试剂，不同结合垫的应用效果总结如下：
1）6613结合垫：不加卡壳释放慢，加样本和稀释液50ul后，液体上行至NC膜顶端后金才开始释放，出现金液分离的现象，导致显色缓慢，一般3分钟后才开始显色，通过优化结合垫处理液配方和胶体金复溶液配方，可以改善。装卡壳后液体被挡板阻挡，缓慢溶解结合物，金液分离现象不明显。15分钟时能完全释放，结合垫上没有残留。
2）6614结合垫：释放快，液体能迅速溶解结合物，显色快，但由于结合物释放过快，影响灵敏度，同时由于纤维丝太密，完全释放也需要较长时间，且对于彩色乳胶微球或荧光微球，由于粒径更大，更不容易释放完全，15分钟可能会有残留，尤其是结合物浓度过高时，微球喷涂浓度0.25mg/ml时能完全释放不残留。
3）0800结合垫：6614的平替，结合垫的金快速释放，但是释放很不均匀，15min后显色较弱。
4）8880结合垫：释放速度较快，快于8980，介于6614和6613之间。
5）8975结合垫：释放非常慢，金液分离现象很明显，13分钟勉强能够释放完，但15min后显色最强。
灵敏度与释放速度呈负相关，8975灵敏度最高但释放最慢；8980释放均匀且灵敏度较高；其次是6608；其次是6613，再其次是8880结合垫。综合释放速度、灵敏度、喷涂外观，推荐使用8980、6608和8880作为结合垫。
3.2 荧光层析试剂，不同结合垫的应用效果如下：
1）6613薄厚不均，8950、8975太薄，结合物喷涂时会喷透。
2）5分钟和15分钟信号值偏差从小到大排序（也反应了结合物的释放速度，偏差越小说明释放速度越快）：8950<0800=6608<6614<8980<6613<8975。厂家资料介绍8950材质薄，结合物释放快，适合有一定粘性的样本。本试验结果也显示释放速度是最快的。但同样材质较薄的8975结合垫，结合物释放非常缓慢，说明材质本身的性质决定了释放速度，与材质的厚薄关系并不显著。
3）用处理液 20mM BB8.0+0.3%Casein+5%糖+1%吐温20+0.5%K30，对结合垫8980、6608、6614处理后再比对，结果显示释放都好，6608=6614>8980。信号值8980>6608>6614，8980比6608信号值高30%,6608比6614信号值高90%。综合考虑选择6608和8980。
4. 精密性
奥斯龙的资料比较了不同结合垫材质的精密性，8980精密性最优，其次是6614，如下：
![APT])[MHAG{)(3K(82]P7{R](http://42.192.127.247/uploadfile/ueditor/image/202511/176371650967bed0.png "APT])[MHAG{)(3K(82]P7{R")
肺炎支原体IgM胶体金试剂优化经验，相同的结合垫处理液，重复性排序（CV从小到大）：8980<6613<6608<0800=6614。另外出现过不装卡精密性比装卡精密性好的情况，怀疑是卡间压实程度存在差异，或者是试剂条装卡不均一。
荧光层析试剂重复性排序（CV从小到大）：8980<8950<6608<0800<6614。
4. 结合垫处理液配方研究
下面以案例的形式展示结合垫处理液配方对试剂性能的影响
4.1 肺炎支原体IgM抗体检测试剂（胶体金法）
民佑生物层析用肺炎支原体天然抗原（浓度1.5mg/ml），用包被液（划膜液）稀释至0.5mg/ml，即1份抗原2份包被液混匀，按照1ul/cm的速度在NC膜划线。凌思生物80nm高浓度胶体金标记抗人IgM二抗，复溶后喷涂到用不同结合垫处理液处理的结合垫上。5ul样本（阳性参考品PX1-PX10）+50ul样本稀释液，15分钟观察结果。
结合垫6614，设计以下处理液配方：
结果显示，所有不含Casein的配方结合垫上均有胶体金残留，可能是Casein对结合垫的封闭更加充分（因为Casein封闭能力比BSA和表面活性剂更强），可以抑制胶体金对结合垫的非特异性吸附。所以结合垫处理液配方中需要含有Casein。
在含有Casein的基础上，验证添加不同种类表面活性剂、高分子化合物、糖，对灵敏度的影响，设计配方如下：
结果显示，对照+PVP K30配方的结合垫显色更深，对照+BSA显色较弱；其余处理差异不大；处理19-22：1%蔗糖的显色最深，其余显色差异不大；处理23-26：S9显色最强，其次是TW-20+S9，其余显色差异不大，表面活性剂Tween和 Triton会影响显色。
尝试将灵敏度高的几个处理组合到一起：
结果显示，编号30处理液处理结合垫，灵敏度较高，且释放迅速。
在结合垫8880和6608上，对以上优选出来的处理液进行比较，检测企业参考品PX1-PX10：
8880结合垫：配方①
8880结合垫：配方②
![J03GHX113_58OQPCMS]3(5O](http://42.192.127.247/uploadfile/ueditor/image/202511/1763716709ec6f3e.png "J03GHX113_58OQPCMS]3(5O")
6608结合垫：配方①
![XY4H(E{LX%BP]4)_%K4GI0X](http://42.192.127.247/uploadfile/ueditor/image/202511/1764151668329470.png "XY4H(E{LX%BP]4)_%K4GI0X")
6608结合垫：配方②
结果显示，8880和6608结合垫，选择处理液配方0.05M Tris-Hcl ph7.4+0.3% Casein+0.5% PVP K30+5% 蔗糖+1% S9+0.1%防腐剂+0.2%BND-10。灵敏度不低于北京贝尔和珠海丽珠肺炎支原体IgM抗体检测试剂（胶体金法）。
4.2 TSH检测试剂（荧光层析法）
第一轮系统验证结果显示：
糖浓度：10%糖浓度释放不好，但是糖浓度低于5%释放也不好，最优的浓度为5%。高浓度的糖对释放或稳定的的作用机理之一是糖起隔离作用，使微球不直接与玻纤及其胶黏剂接触，玻纤及胶黏剂裹了一层糖，其相互作用弱化，释放更均匀。而无糖的时候，微球与玻纤及胶黏剂直接接触，其保留时间更长。
PVPK30与Triton X-100复配，无增强信号作用，无降低CV作用。
聚乙烯醇PVA无论与吐温20还是Triton X-100复配均有降低信号值的作用。
PVPK30提升量至1%后，残留反而更多，说明1%的PVPK30对释放有负面影响，这与默克、GE文章结论不一致，分析1%的PVPK30可能量过大，聚合物本身溶解慢导致，表观“溶出”微球更慢。
吐温和PVPK30复配后增强信号值10%，且对CV有改善作用。最优浓度为1%吐温20+0.5%PVPK30。
综上，糖是必要的，糖的浓度也不能过高保持浓度5%，吐温20对释放起积极作用，用量1%，可继续提升至1.5%，PVPK30量大了不好，保持量为0.5%。
第二轮设计配方验证蛋白0.5%BSA、0.3%Casein；表面活性剂吐温20不同浓度；表面活性剂0.25% S9；高分子化合物0.5% PVPK30。
结果显示：结合垫不处理释放也较好，但是跑板不干净，背景有红色。蛋白用0.5%BSA不利于释放，蛋白用0.3%Casein有利于释放。无表面活性剂时垫疏水，加样本时样本不易渗透到垫上，所以必须要有表活。吐温20释放效果优于S9，吐温20浓度对释放的影响差异不大，但是高有利于跑板干净。最好是0.5%以上。PVPK30不利于释放，功能趋近于流动封闭，改善背景，但也会增加丝状释放的风险。有了吐温20，最好不要K30。最终优选的配方是: 20mM Tris pH7.4+5%蔗糖+0.3%Casein+1%吐温20+0.1%防腐剂+0.2%BND-10。
注：以上仅是本试验验证结果，仅供参考，不同产品需要根据设计自己优化配方。
来源：IVD二十载
声明：本网站注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！
嘉中蓝海AccuSift有表活套装S1-25及多种信号增强剂，液体防腐剂MB-1是PC300升级版，性能更优。
