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羧基微球是常见的微球类型之一，通常通过丙烯酸或甲基丙烯酸单体的共聚或接枝反应制备。但由于羧基基团表面密度存在差异，不同厂商和原料来源的羧基微球特性也会有所区别。微球表面基团密度的测量指标称为“停泊面积”（PA），即每个官能团占据的平均面积（平方埃，A²）。不同厂商羧基微球的平均“停泊面积”差异显著，范围从约10A²（0.1nm²）到超过125A²（1.25nm²）。每125A²处有一个羧基基团，相当于在边长为11.1A×11.1A（1.11nm×1.11nm)的正方形区域内分布一个羧基基团。单个羧基官能团从颗粒表面突出时，其直径约为2.2埃，赖氨酸占据的空间约为8.7×4.8埃，白蛋白（67kDa）这样的大分子有效分子直径约为70埃（7纳米），IgG分子（150kDa）的直径则达到约110埃（11纳米）。当每125平方埃存在一个羧基时，仍会有大量未带电的聚合物表面暴露在外，这可能成为非特异性结合的来源，尤其是当微球表面的聚合物结构具有疏水特性时。蛋白质与这类羧基微球结合时，可能与暴露的疏水聚合物表面相互作用发生解折叠并导致变性。反之，对于高羧基密度微球，每10埃²（0.1纳米²）的微球表面就存在一个羧基，这种高密度表面将提供更多的反应位点用于蛋白质的共价交联，同时更有效地用负电荷掩盖微球的疏水聚合物表面。这可能有助于通过负电荷排斥维持稳定的颗粒悬浮液，同时防止非特异性结合或表面蛋白质变性。

羧基微球可通过多种方法活化，生成能够与蛋白质及其他生物分子中的亲核试剂发生偶联的活性中间体。下图展示了部分可用于将含胺分子与羧基微球偶联的反应，这些反应均能形成稳定的酰胺键。

水溶性反应（如EDC/NHS）的活化和偶联过程均可在完全水相条件下进行，但某些反应（如DCC/CDI）需要在有机相中完成活化步骤，以防止活化剂或活性中间体发生水解。对于能在非水环境中保持稳定的颗粒，有机溶剂活化是一种可行方案。但需注意的是，部分聚合物微球在有机溶剂中可能过度膨胀或部分溶解，导致材料受损。而采用交联单体制备的聚合物颗粒通常能耐受有机溶剂而不受损。

目前，将蛋白质及其他含胺分子与羧基微球偶联最常用的方法是采用EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺）介导的水相碳二亚胺反应。该反应既可采用一步法（所有反应组分同时参与）进行，也可通过两步法更精准控制偶联过程。在一步法反应过程中，微球表面的羧基基团首先与水溶性碳二亚胺发生活化反应，生成中间体EDC酯，这些酯类物质可直接与蛋白质或其他分子上的胺基发生反应形成酰胺键，但是中间体酯在水溶液中不稳定，可能未经偶联蛋白就水解回羧基，且PH值越高水解速度越快，另外，一步反应中大多数蛋白质因同时存在胺基和羧基而引发的碳二亚胺介导蛋白质聚合反应，导致偶联效率偏低。因此最常用的偶联反应是两步法，羧基被EDC活化后通过添加NHS或Sulf-NHS形成次级中间活性基团NHS酯和磺基-NHS酯，这些次级酯在水溶液中具有更高的稳定性，因此后续与蛋白质的偶联反应通常能获得更高产率，此外，通过生成次级（磺基）NHS酯，可在添加蛋白质前从颗粒中去除过量EDC，从而避免碳二亚胺介导的蛋白质聚合反应。

在微球偶联反应中，保持微球间的排斥力对稳定胶体悬浮液至关重要，即使在活化和偶联反应过程中也不例外。因此，在此反应中使用Sulf-NHS替代NHS会生成具有强负电荷的中间酯类物质，相较于原始羧酸盐，Sulf-NHS酯上的磺酸基团能更有效地防止粒子聚集，从而使得活性中间体粒子能够轻松从过量反应物中纯化，并与蛋白质混合进行偶联。若在此反应中使用未磺化的NHS，其不带电的中间产物可能引发不可接受的粒子聚集现象。

EDC两步法偶联工艺流程（参考）

活化

1.将微球（例如100毫克的1μm羧基化乳胶微球）悬浮于5毫升偶联缓冲液（50 mM MES，pH 6.0)中。可添加稀释的去污剂溶液以提高微球稳定性并防止结块（例如0.01% SDS)。避免添加任何含羧酸盐或胺类的成分（如乙酸盐、甘氨酸、Tris、咪唑等）。同时，避免存在硫醇类物质（例如DTT、2-巯基乙醇），因为这些物质会与EDC反应并使其完全失活。

2.加入100mg的EDC和100mg的sulfo-NHS，混合以溶解。为了促进更快的溶解，EDC和sulfo-NHS可以立即溶解为反应缓冲液中的浓缩储备溶液，然后将该溶液的一小部分添加到颗粒悬浮液中，以获得正确的最终浓度。

3.在室温下反应15分钟。

4.用偶联缓冲液快速洗涤微球两次，使用离心机，然后用超声波穿刺针将磁珠重悬于5ml相同缓冲液中。

偶联

5.将待偶联蛋白溶解于5毫升偶联缓冲液中，其用量达到所用微球单层最大理论浓度的1-10倍（根据所用微球的数量和类型确定）。若微球生产商提供的羧基浓度以meq/g为单位，则该浓度相当于μmoles/mg。建议优化最佳蛋白浓度。注意：蛋白浓度过低可能导致微球交联。对于价格昂贵的抗体，若无法获得足够数量以达到颗粒表面最佳摩尔比时，可添加其他蛋白质（如牛γ球蛋白或牛血清白蛋白）来填补剩余反应位点。

6.将蛋白溶液与微球混合并充分混合。

7.室温下震荡反应2至4小时。

8.用偶联缓冲液洗涤微球，并将其重悬于含有100 mM含胺亲水性淬灭分子（例如乙醇胺或Tris)的相同缓冲液中，以阻断过量反应位点。

9.洗涤微球，重悬于适当的缓冲液中以备储存。

实践经验偶联工艺如下：

4. 荧光微球凝集及改善

荧光微球的材质是疏水的聚苯乙烯或聚苯乙烯共聚物，表面修饰有羧基基团，微球表面的电荷排斥效应和纳米级别的粒径使其保持相对稳定的状态。但是颗粒之间的电荷排斥效应可能受到溶液缓冲剂和盐成分的严重影响，电荷可以通过可电离基团的质子化或去质子化，以及溶液中离子浓度的调节来消除或中和。大多数因同电荷排斥而在悬浮液中稳定的颗粒类型，若pH值改变或缓冲液/盐浓度过高时，会发生聚集。特别值得注意的是，通过EDC/NHS两步反应活化羧基时，原本带负电的羧酸盐在活化后会变电中性，增加凝集的风险，使用Sulf-NHS代替NHS，可在中间体上引入比原始羧酸盐能产生更强负电荷的磺酸基团，从而改善凝集，但在某些情况下，这种负电荷排斥作用的增强会导致活化步骤后无法通过离心法使颗粒沉淀。

根据这些理论，改善微球标记过程的凝集、沾壁，可以从以下几个方面进行尝试：

①活化和偶联缓冲液避免含有高离子强度：活化最适的缓冲液包括20mM PH5.5 HEPES、20mM PH5.5 MES、纯化水。偶联的最适缓冲液可以和活化液相同，也可以更换为20mM PH8.0 HEPES/硼酸盐BB。

②活化和偶联缓冲液中添加表面活性剂：0.01%SDS、0.1%CHAPS、0.01%消泡剂D248。或者活化液中加0.05%吐温20，偶联液中不加表面活性剂，不沾壁。

③改变微球的活化程度：EDC加入过量会导致微球团聚。一般10ul微球（10mg/ml）用100ul活化缓冲液调整浓度至1mg/ml，加入EDC（5mg/ml）10uL 和NHS（5mg/ml）16uL，如果活化过程中或偶联抗体的过程中出现微球凝集，可将上述EDC和NHS的分别降低为2ul和10ul。

④使用Sulf-NHS代替NHS。

⑤最适的标记抗体量：标记的抗体量过低，抗体可能会介导微球之间的偶联，导致聚集，提高标记量可以改善。常用的抗体标记量为70~120ug抗体/mg微球。

⑥降低微球的反应浓度：一般微球的活化反应浓度是1mg/ml，可降低活化反应至0.5mg/ml试验。

⑦标记过程中，每一步充分的超声，可以使微球更好的分散。注意：喷垫前需要充分超声，更好的分散微球，避免释放不好，堵膜的现象。

⑧更换微球厂家或活材配对。微球和活材的性质也是影响偶联过程凝集现象的关键因素，对于各种方法都尝试仍旧无法解决的情况，只能尝试分别更换再验证。

来源：IVD二十载

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