乳胶微球、荧光微球、磁性微球的主流偶联/包被工艺是化学共价交联，但是仍有一些乳胶微球是依靠被动吸附来完成包被，而且有研究表明被动吸附是化学交联的基础，被动吸附作用力提供了蛋白与微球表面的初次靠近，随后在偶联剂的作用下实现化学共价交联。因此即使是研究化学交联，被动吸附的理论基础仍能提供重要的工艺依据。
2.微球的被动吸附标记
将生物分子固定在疏水性聚合物颗粒上的最简单方法之一是采用被动吸附。在免疫检测中使用微球的早期案例包括将抗体或抗原非共价吸附于乳胶微球表面。蛋白质吸附到疏水性颗粒的过程，是通过非极性或芳香族氨基酸残基与颗粒表面聚合物的强相互作用实现的。由于蛋白质通常具有疏水核心结构且表面以亲水性为主，它们与疏水性颗粒的相互作用必然涉及显著的构象变化，从而形成大规模疏水接触。这种构象变化往往会导致最先吸附到颗粒上的蛋白质层完全变性。后续蛋白质与初始层通过蛋白质-蛋白质结合或聚集被吸附，这最终导致形成蛋白质簇，在这些簇中，外层蛋白质具有更接近天然的构象和活性。由于蛋白质在疏水表面容易形成多层包被结构，因此在吸附过程中添加的蛋白质量需控制在微球理论上能吸附的单分子层量之外。若向微球中添加过量蛋白质，可能导致结构高度不稳定，从而持续释放松散吸附的蛋白质。多数实验方案建议将蛋白质浓度设置为微球理论单分子层浓度的3-10倍。通过牛血清白蛋白（BSA，分子量67kDa)的吸附能力可估算特定蛋白质以单分子层形式结合颗粒表面的最大量，例如BSA在微球表面的吸附容量约为3毫克/平方米。像抗体（IgG；分子量150kDa）这类较大的蛋白质，其最大吸附密度约为每平方米颗粒表面2.5毫克。举个实际例子：1克1μm聚苯乙烯微球可吸附约18毫克牛血清白蛋白（BSA）或15毫克IgG。通过掌握每克颗粒的比表面积数据，就能合理估算特定蛋白质相对于抗体或白蛋白分子尺寸的最大吸附容量。
被动吸附技术因其在抗体分子固定化应用中的重要性而备受关注，主要涉及将抗体分子固定于微孔板（聚苯乙烯）或微球（由不同成分组成的疏水珠）等载体表面。虽然自1956年布尔研究白蛋白在玻璃表面的吸附现象以来，人们已知蛋白质被动吸附会导致变性效应，但直到后续多项研究发表后，这一危害性才被广泛认知。疏水表面被动吸附对生物分子的有害影响可能非常显著。Butler等人（1993年）研究发现，超过90%的单克隆抗体和约75%的荧光素多克隆抗体在吸附到聚苯乙烯表面后会发生变性。此外，Bagchi和Birnbuam（1980年）观察到，当pH值接近抗体等电点时，IgG能最佳吸附于聚乙烯基甲苯颗粒表面，这表明相互作用完全属于疏水性质且不依赖电荷作用。然而，一旦抗体被吸附，只要pH值维持在初始吸附点，它就会与表面紧密结合。如果进行任何pH循环操作（例如某些洗涤步骤中可能发生的），吸附的抗体会倾向于从表面脱落，从而揭示了这种相互作用的非共价性质。因此，蛋白质吸附到疏水性聚合物颗粒上时，应在特定蛋白质的等电点或其附近进行，以确保蛋白质以最高密度附着在颗粒上。处于等电点的蛋白质会呈现最可能的折叠构象，因为电荷排斥效应对整体球状结构的影响并不显著。在等电条件下吸附后，每个蛋白质都能以最大密度结合到聚合物表面。因此，大多数用于被动吸附的缓冲液配方建议将pH条件设置在蛋白质等电点范围内的某个位置。由于许多蛋白质具有多种不同的生物修饰（翻译后修饰），导致其等电点值存在差异，可能需要进行优化以确定吸附过程中最佳的pH条件。
另一个需要考虑的因素是可供吸附的蛋白质含量。如果使用少量昂贵抗体被动吸附到聚合物颗粒表面，往往无法使颗粒表面达到饱和状态。这种情况下，可在混合液中添加另一种载体蛋白或封闭蛋白，以占据颗粒表面原本未被利用的位点。这能有效避免因低浓度蛋白质吸附导致的颗粒聚集现象。常用的载体蛋白包括白蛋白或多克隆IgG抗体库（如牛γ球蛋白）。其他标准蛋白质封闭剂也可用于与目标抗体混合，例如酪蛋白、脱脂奶粉蛋白、鱼血清等。
聚合物颗粒的组成对蛋白质吸附量及其固定化后的稳定性与活性具有重要影响。通常，当疏水性单体与带电荷单体（如丙烯酸或甲基丙烯酸酯）共聚形成共聚物混合物时，其表面会同时呈现疏水特性与电荷区域。吸附在这些共聚物颗粒上的蛋白质通过疏水作用和正负电荷相互吸引与表面发生作用，从而有效降低吸附过程中的蛋白质变性，并显著提升固定化后的活性保持能力。Bale等人（1989年）对蛋白质在纯聚苯乙烯和几种其他共聚物颗粒上的吸附进行了比较，得出的结合亲和力顺序如下：聚苯乙烯>聚苯乙烯/PMMA共聚物> PMMA >聚苯乙烯/聚丙烯酸共聚物。因此，纯疏水性聚合物材料虽然能强力吸附蛋白质，但在初始接触界面处最容易导致蛋白质变性。而含有极性或负电荷特征的共聚物虽对蛋白质的吸附能力较弱，却能更有效地保持活性。在整体疏水表面结构中引入部分亲水性极性基团，这一策略已在聚苯乙烯微孔板应用中获得成功，正如大多数高结合力微孔板所采用的设计方案，其孔板表面分布着大量极性成分，从而同时实现疏水作用与电荷或偶极相互作用的协同效应。由于部分蛋白质在固定于疏水表面时可能发生严重变性，因此采用共价键法将蛋白质偶联至亲水性更强的颗粒表面，可能是维持天然蛋白结构和长期稳定性的更优选择。
工艺流程
（1）将微球稀释至质量浓度为10 mg/ml（1%）的包被缓冲液中，其pH值应接近待吸附蛋白质的等电点。若微球聚集成为问题，初始微球浓度可降低至5 mg/ml。一些典型的包被缓冲液建议包括：(a)10 mM磷酸钠+0.15 M氯化钠 pH 7.4（PBS）；(b)50 mM硼酸钠 pH 8.5；(c)50 mM醋酸钠 pH 3.6至5.6；(d)25 mM MES pH 6.1；(e)50 mM碳酸氢钠 pH 8.5至9.5。如需提高蛋白质稳定性，可在这些缓冲液中添加终浓度为0.15 M的氯化钠。但需避免使用表面活性剂或变性剂，因为这些物质会与蛋白质吸附竞争或削弱疏水相互作用强度，从而影响吸附效率。
（2）将待吸附的蛋白质溶解在包被缓冲液中，使其浓度达到该蛋白质在微球上最大单层密度的约3至10倍过量。注：一个有效的策略是进行蛋白质滴定实验，即在固定微球量的前提下尝试不同浓度的蛋白质。例如，使用300纳米乳胶颗粒时，合适的试验方案应采用每毫克颗粒约10至200μg蛋白质的浓度范围。通过绘制包被反应中添加的蛋白质量与结合量的关系曲线，即可获得确定最佳蛋白质浓度的关键数据。
（3）将蛋白溶液加入微球悬浮液中，快速混合。小体积操作可采用移液枪头上下抽吸或涡旋振荡的方式进行混合；大体积操作则可用搅拌棒或桨叶辅助。部分实验方案建议将微球加入蛋白溶液中以获得最佳初始混合速率，从而确保微球在整个悬浮液中均匀包覆。关键在于实现快速高效的混合，使蛋白与微球形成均匀混合物，确保吸附作用能在每个颗粒表面均匀发生。
（4）在室温下混合悬浮液1小时。
（5）通过离心或切向流过滤去除多余蛋白质。使用台式离心机通常能成功沉淀大量颗粒，特别是当颗粒直径超过约150纳米时效果更佳。若存在沉淀过程中颗粒结块问题，或颗粒尺寸过小难以有效沉淀，则过滤是更优选择。建议用包被缓冲液对颗粒进行至少两次离心和洗涤，确保完全去除未结合的蛋白质。若需彻底重悬颗粒，可采用超声波处理，特别是将超声探头浸入溶液中进行操作。
（6）将颗粒重新悬浮至最终浓度为1%，置于含有防腐剂的包被缓冲液中。避免改变储存缓冲液的组成与包被蛋白质时所用的成分不同，因为任何pH值或成分变化通常会导致部分吸附蛋白的洗脱。
（7）使用适当的蛋白质分析技术测定颗粒上吸附的蛋白质量。
来源：IVD二十载
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