荧光微球是一类在纳米到微米尺度上含有荧光物质的功能性微球，在外加能量(如光、电等)的激发下能够发射出特定波长的荧光。这类材料具有稳定的物理形态和化学结构、良好的单分散性和均匀的粒径分布，以及高效而稳定的发光效率。荧光微球具有较大的比表面积，可以轻松有效地固定捕获试剂，只需要极少量的样品，实现高灵敏的检测。目前POCT检测中常用的荧光微球有时间分辨荧光微球、量子点荧光微球、上转发光荧光微球。
时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)，采用镧系稀土离子如铕（Eu）、钐（SM）、镝（Dy）、铽（Te）作为发光物质，这种物质有几个优点：（1）荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，获得很高的灵敏度。（2）Stockes位移大，StoKes位移是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。波长差越大，越容易将两个波长区分开来，排除干扰。例如铕的激发光波长340nm，发射光波长613nm，两者之间的波长差为273nm，而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差为28nm，很难排除激发光对发射光的干扰。（3）镧系元素的发射光谱很窄（615±5nm），狭窄的发射峰，通过波长分辨，很容易将特异性与非特异性荧光分辨开来。
量子点荧光微球（Quantum Dot Fluorescent Microspheres），采用量子点（Quantum Dots） 作为发光物质，量子点是由硒化镉（CdSe）、碲化镉（CdTe）、硫化镉（CdS）、硒化锌（ZnSe）、磷化铟（InP）或砷化铟（InAs），或是CdSe核上包裹一层ZnS或CdS组成的纳米晶或半导体纳米晶。量子点具有以下特性和优点：（1）荧光强度高，量子点的摩尔消光系数是传统有机荧光染料（如FITC、Cy3）的 10-100 倍，且荧光量子产率高（优质 CdSe/ZnS 量子点量子产率可达 90% 以上）。（2）抗光漂白性好，量子点的无机晶体结构能抵抗光氧化损伤，抗光漂白能力是有机染料的100-1000 倍，可以耐受多次激发，且可长时间稳定发光（如生物成像中连续照射数小时仍保持荧光强度）。（3）发光颜色多样，量子点的荧光发射波长由其尺寸和组成决定，通过调整量子点的制备参数，可实现微球荧光颜色的精准调控，基于此，只需制备出尺寸/组成不同、但激发光谱均覆盖同一激发波长的多种量子点，即可用单束激发光让它们分别发出蓝、绿、红等不同波长的荧光，轻松满足多通道检测需求。（4）波谱范围宽，激发光谱覆盖范围宽，单波长可激发；与宽激发光谱相反，发射光谱是窄峰。因此，选择一个能量足够高、且落在所有目标量子点激发光谱重叠区的波长（如405nm 或 488nm），即可同时激发多种不同的量子点。（5）荧光寿命长，量子点的荧光寿命一般在30～100ns，这个时间比背景荧光及大部分样本基质的拉曼散射光要长很多，因此可以减弱甚至消除背景荧光的影响。
上转发光微球（Up-Converting Phosphor Microspheres），采用上转发光材料作为发光物质，这种材料吸收低能量的长波长光（如近红外光）后，通过特定能量转换机制，发射出高能量的短波长光（如可见光、紫外光） 的过程，其能量转换方向与常规 “吸收短波长光、发射长波长光” 的荧光完全相反，因此也被称为 “反斯托克斯发光”（Anti-Stokes Luminescence）。材料由稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中构成，有三种主要的成分：主基质（氟化物晶体）、吸收子和发射子（稀土金属）。吸收子和发射子这一离子对在主基质晶格内适宜的空间取向和距离，是产生上转换发光的基础。吸收子被近红外光（如 980nm 激光）照射至激发态，随后将能量转移给相邻的发射子，多个吸收子持续向同一个发射子传递能量，使其电子逐步跃迁至更高激发态，当高能级电子回到基态时，释放出高能量的可见光。上转发光具有以下特性和优点：（1）激发光为近红外光，生物相容性极佳（核心优势），适合深层组织成像。（2）高敏感性，生物体内的蛋白质、核酸、辅酶等物质仅会被可见光/紫外光激发产生自荧光，而对近红外光无响应。因此，上转发光检测时，背景信号极低。（3）光稳定性强，无光漂白现象，可在连续激光照射下（如 激光照射数小时）保持发光强度基本不变，适合长时间动态监测（如细胞代谢过程观察）。（4）高度的灵活性，不同的吸收子、发射子、主基质结合可使UCP 具有不同的光学性质，自由组合的多样化特征光谱（吸收光谱和发射光谱），使其可同时适用于定量分析与多重分析。
荧光微球是由可溶胀的聚合物乳胶颗粒为核心，将以上的荧光物质包裹在其中制备而成。聚合物颗粒可由多种不同单体或共聚物组合构建而成，常见的类型包括：聚苯乙烯（传统“乳胶”颗粒）、聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物、聚苯乙烯/丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚甲基丙烯酸羟乙酯（pHEMA）、聚乙烯甲苯、聚苯乙烯/丁二烯共聚物以及聚苯乙烯/乙烯甲苯共聚物。通过在聚合反应中混入功能单体组合，可在颗粒表面形成活性基团或官能团，便于后续与亲和配体结合。例如聚苯乙烯/丙烯酸共聚物颗粒会在表面生成羧基基团，其数量取决于聚合过程中所用单体的比例。
常见的聚合物微球都具有疏水性表面，例如含苯乙烯的聚芳烃类。这类颗粒若经过表面改性处理（如添加电荷或亲水基团），能有效掩盖其内部的聚合物核心。部分此类结构通过接枝亲水性表面来限制非特异性结合，从而形成更易生物相容的颗粒，既不会因疏水作用导致变性，也不会与蛋白质发生非特异性结合。某些由亲水性单体构成的聚合物颗粒则展现出更优的生物相容性。聚-HEMA（聚羟乙基甲基丙烯酸酯）因其富含羟基而具有极强亲水性，无需表面改性即可实现优异的生物相容性。
微球的尺寸、表面成分和密度会直接影响其在悬浮液中的行为表现，进而影响偶联过程中的偶联方案，特别是处理和洗涤技术的选择。通常情况下，微米级的大颗粒会因重力作用逐渐沉降，但随着颗粒尺寸缩小，当达到特定临界值时，就会形成真正的胶体悬浮体系，此时无论悬浮时间多长，颗粒都不会发生沉降，这个临界点通常出现在颗粒尺寸约100纳米时，此时布朗运动会使水分子与具有足够力质比的颗粒碰撞，从而阻止其因重力作用沉降。
在微球表面添加羧基基团可使颗粒稳定，并通过电荷排斥防止聚集。这一现象的前提是溶液的pH值需维持在约pH 5以上，以确保羧基不被质子化并保持其负电荷特性。若缺乏表面电荷产生显著的排斥效应，微球会因疏水性表面相互作用和范德华力而迅速聚集并沉降，颗粒越小，范德华吸引力可能变得越显著。相比之下，像聚羟乙基甲基纤维素（pHEMA）这类亲水性较强的颗粒，即便尺寸微小也能保持胶体稳定性。这是因为颗粒在水溶液中会形成水合层，这种由氢键和偶极相互作用形成的紧密水膜与极性表面基团相互作用，使得水合层难以被去除或穿透。
微球之间的电荷排斥效应可能受到溶液缓冲剂和盐成分的严重影响。电荷可以通过可电离基团的质子化或去质子化，以及溶液中离子浓度的调节来消除或中和。例如，将溶液的pH值降低至低于表面羧酸盐的pKa值时，这些羧酸盐就会被质子化。对于大多数颗粒而言，尤其是具有疏水表面的颗粒，这将导致颗粒因表面负电荷的丧失而聚集。同样地，高盐浓度会通过使过多带正电的离子与表面负电荷结合，有效掩盖羧基化颗粒的电荷特性。大多数因同电荷排斥而在悬浮液中稳定的颗粒类型，若pH值改变或缓冲液/盐浓度过高时，也会发生聚集。成功处理小颗粒的挑战之一在于维持最佳溶液特性，以确保颗粒在整个偶联过程中保持分散。这包括所有用于偶联亲和配体并随后将其应用于预期用途的活化、偶联和洗涤步骤。因此，对于每种用于偶联配体的颗粒类型，在进行任何偶联反应之前，都应首先了解其物理特性和溶液特性。
在实际进行亲和配体偶联前，微球处理的另一个关键环节是确定最佳清洗流程以去除未反应配体或偶联反应副产物。对于少量颗粒，通常采用离心法即可；若处理极小尺寸的纳米颗粒，则可选用凝胶过滤层析或分子筛层析。膜过滤技术也是可行方案，尤其适用于较大微米级颗粒。当溶液体积和颗粒数量足够大时，切向流过滤可作为其他分离方法的有效替代方案。虽然理论上许多颗粒类型都能通过离心法从溶液中分离，但有些颗粒在沉淀过程中可能会发生不可逆的聚集，这类情况必须避免离心处理。颗粒表面的相对疏水性与电荷量直接影响其聚集倾向，这种特性在很大程度上决定了离心后能否成功重新悬浮颗粒群体。特别需要注意的是，具有较高表面电荷密度的颗粒通常能在离心后成功重新悬浮。为促进再悬浮，建议对离心后的颗粒进行超声处理，可采用浴式超声仪或超声探头来破碎沉淀物。需注意避免使用涡旋混合法，因其对离心沉淀的小颗粒分散效果欠佳。在使用离心或其他分离技术前，建议先联系生产商确认是否提供颗粒处理指南。
总体而言，随着颗粒尺寸减小，在恒定体积的溶液中，相同质量的颗粒所占摩尔浓度会相应增加。例如，1毫克的1μm乳胶微球所含颗粒数量，远少于同等质量的50纳米纳米颗粒。因此，当两种颗粒以相同质量悬浮于等体积溶液时，纳米颗粒在溶液中的有效摩尔浓度将显著高于相同质量的微粒浓度。此外，对于相同质量的颗粒而言，随着直径减小，其表面积与质量之比也会相应增大。此外，当颗粒质量保持不变时，随着直径减小，颗粒的表面积与质量之比会增大。这意味着纳米颗粒可用于共轭反应的总表面积远大于微米颗粒。若两种颗粒表面都含有相同的功能基团（如羧基）和大致相同的表面密度用于结合亲和配体，则在相同质量的颗粒中，溶液中这些功能基团的有效浓度在纳米颗粒中会显著高于微米颗粒。因此，相较于使用微粒进行的相同反应，采用纳米粒子进行偶联反应时需要考虑更高的反应活性，这源于纳米粒子溶液中功能基团的有效浓度更高。随着颗粒尺寸减小和浓度增加，可用表面积随之扩大，反应性基团的有效浓度也会同步提升。在优化纳米粒子偶联反应时，必须综合考量这些因素。这意味着针对1μm羧基化微球的蛋白质偶联最佳方案，很可能需要重新优化才能适用于羧基化纳米粒子。
来源：IVD二十载
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