1蛋白与胶体金结合最佳pH测定（供参考）
蛋白质标记前预先在5mM PH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，以去除多余的盐粒子，然后10000转/min离心10分钟去除聚合物。以0.1mol/L K2CO3调胶体金溶液的PH值。
(1)取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 胶体金；
(2)用0.1mol/L K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；
(3)取一96孔板，按pH从低到高将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；
(4)每孔分别加入3ul浓度为1 mg/ml的蛋白，混合，室温下放置10-15 min；
(5)每孔分别加入10ul浓度为10％ NaCl溶液，混合，室温下放置10 min；
(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；
(7)重复(1)-(5)步，pH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。
(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。
注意：如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加NaCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积（1ml胶体金），并借助离心来判断。有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。
2 最小标记蛋白量的确定
(1)用0.22um微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；
(2)取一96孔板，分别加入最佳pH的胶体金100ul，每个条件重复3次；
(3)各孔依次加入不同量的蛋白1～20ul，混匀，室温下放置15min；
(4)加入20ul 10％ NaCl，室温下放置10min；
(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。
(6)为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。
注：在实际标记物制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的130％。
3 抗体标记胶体金（参考方法一）
(1) 取两个1.5 ml试管，分别加入1.0 ml 60nm胶体金；
(2) 根据确定的最佳标记PH值，用0.1mol/L K2CO3把胶体金溶液pH调整到预期值（大多数单克隆抗体的最佳标记pH值7-9区间）；
(3) 根据确定的最佳抗体标记量，额外增加10%，加入到胶体金溶液中，充分混匀。一般每毫升金胶体溶液添加10至14微克抗体可获得最佳标记效果（例如加入10-14ul浓度为1mg/ml抗体）。室温放置10min；
(4) 加入10ul 10%BSA，或3%Casein，或2%PEG20000，室温放置10 min；
(5) 10000rpm离心20 min，轻轻吸除上清；
(6) 用适量体积的复溶液悬浮松散的胶体金沉淀。
注意：1)不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；2)不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分标记物形成松散沉淀为原则。离心力太大，会产生不可逆的标记物凝聚；离心力太小，标记物无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。3)在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，标记物活性较好。4)IgG的最佳交联pH有多种报导，从7.4-9.0。一般认为，7.4时胶体金结合的蛋白最多，9.0时制备的标记物最稳定。
4 抗体标记胶体金（参考方法二）
(1) 取1个1.5 ml离心管，加入凌思生物100 OD高浓度60nm胶体金400ul；
(2) 然后加入600ul硼酸盐缓冲液（20mM PH 9.0）混匀，使胶体金浓度为40 OD；
(3) 加入抗体40ug，4度孵育20min；
(4) 1ml金标抗体溶液中添加50μl封闭液（6% Casein），Casein终浓度为0.3%；或1ml金标抗体溶液中添加10μl封闭液（10% BSA），BSA终浓度为1%；封闭15min；
(5) 6000rpm离心4 min，轻轻吸除上清；
(6) 用0.4ml-1.0ml复溶液重悬胶体金沉淀。
标记过程死金的问题和处理
标记缓冲液的离子强度太高：离子强度太高会中和胶体金表面的电荷，导致胶体金不稳定。
标记缓冲液的PH值：胶体金带负电，偏酸的标记缓冲液PH值容易导致胶体金不稳定，死金。
离心条件：离心转速高、离心时间长容易导致死金。降低离心转速和时间，对复溶后短时间金的状态有帮助。例如优选条件，抗体1标记缓冲PH9.0，离心转速6000r/4min；抗体2标记缓冲PH8.0，离心转速3500r/4min。
标记温度：降低标记反应温度至4度，可减少标记过程中的沉淀。
封闭条件：PEG、明胶封闭容易死金，降低BSA用量可减少封闭引起的沉淀。
将胶体金加入到稀释抗体中：先稀释抗体，再加入浓缩的胶体金反应，可降低死金沉淀。复溶后的金喷到结合垫上后，可能会出现死金颜色变灰，不过有时对灵敏度影响不大，轻微死金对灵敏度有帮助。
增加喷金高度，降低喷金气压，将金喷宽，对于减少局部金浓度过高有效，金释放速度更快。
附件：胶体金标记常用的缓冲液
5.胶体金标记物复溶液
胶体金标记物制备好之后，通过离心然后复溶沉淀的方式调整至所需的浓度，然后喷涂结合垫。复溶液的作用包括：1）使胶体金结合物以最佳的浓度均匀的分布在结合垫上；2）使胶体金结合物随着样本流动方向均匀快速流动；3）有利于抗原抗体快速、特异性的反应。复溶液的配方对结合物的稳定性、释放、灵敏度和特异性都有影响，可以说复溶液的组成是试剂条研制成败的决定因素之一。复溶液一般包含：
1）合适的离子种类和强度：通常PH值是7-9，在这个范围内可选的缓冲液主要有Tris、PB和BB。离子强度不宜过高，一般选择10mM-20mM，当使用的离子强度大于0.2M时，有可能造成释放、层析不好或检测结果异常。离子种类也因为胶体金标记物的生物分子不同而有诸多限制，如钙调蛋白可能与Ca2+有关系，而卤素离子对胶体金稳定性似乎有特殊破坏作用。
2）大分子物质：作为胶体金干燥后均匀分布的骨架，大分子的骨架作用对于胶体金产品的释放速度有帮助，常用的大分子物质有PEG20000(0.2-0.5mg/ml)、PVPK30、PEG4000等，PVPK30属于粘度调节剂，控制标记物释放速度，不利于释放，但是背景会更干净。
3）小分子物质：常用的小分子物质有蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等，对对蛋白活性起保护作用，一般首选5-10%的蔗糖。
4）惰性蛋白：保护目的蛋白活性，维持胶体金溶液的稳定胶体状态，消除非特异性反应的封闭物质，其骨架作用有利于分散胶体金颗粒。常用的惰性蛋白有0.5%BSA、0.1-0.3%Casein，脱脂奶粉质量不易控制。
5）表面活性剂：蛋白与胶体金的结合力是非共价键，复溶液中不建议添加表面活性剂，因为在标记物存放过程中表面活性剂可能会竞争性的将蛋白从胶体金表面剥离下来。另外表面活性剂还可能会使胶体金喷涂到结合垫上后不均匀扩散，外观不整齐。如果需要添加表面活性剂，可以考虑添加0.2-0.5%的S9，一种聚氧乙烯和聚丙烯醇共聚的高分子化合物，弱非离子表面活性剂，具有很好的亲水性和良好的分散性能。
附件：复溶液配方参考
来源：IVD二十载
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