胶体金溶液中的金颗粒之间存在两种相反的效应，一方面金颗粒表面有一层氯金酸使颗粒表面带负电荷，导致颗粒间相互排斥，从而防止溶胶发生聚集，另一方面的本质是电磁效应，会导致金属表面与其他分子之间产生范德华引力。在胶体悬浮液中，负电荷排斥力与可能导致凝聚的吸引力之间存在平衡。当金颗粒相互靠近时，必须跨越一个能量势垒才能克服负电表面的排斥特性，进入范德华引力作用区域。通过向溶液中添加能够屏蔽颗粒表面负电荷的电解质，可以突破这一势垒。当电解质达到特定浓度时，胶体将开始坍塌，金颗粒相互吸附形成大团聚体，最终从悬浮液中析出。电解质介导的凝聚作用构成了金与其他分子形成所有结合物的基础。当胶体悬浮液中存在蛋白质等大分子，且电解质浓度升高至超过负排斥效应时，蛋白质分子将优先于其他金颗粒发生吸附作用。因此，悬浮液不会发生聚集和塌陷，而是产生标记效应。蛋白质-金标记中最常见的电解质添加剂是氯化钠或缓冲盐。若不存在大分子物质，单纯添加氯化钠就会导致金颗粒凝聚。这种聚集现象会伴随颜色从橙红色转变为红紫色或蓝色，并可通过580纳米波长处吸光度的变化进行分光光度定量分析。
用裸金颗粒标记大分子的过程涉及一系列目前尚不甚了解的机制。通常认为，胶体金颗粒与蛋白质的链接作用中赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种特异性氨基酸残基发挥着重要作用，但是这三种氨基酸与胶体金连接的作用机制各不相同：赖氨酸带有较强正电荷，因而自然吸附带负电荷的金颗粒；色氨酸主要通过疏水作用力与胶体金连接；半胱氨酸通过巯基与金原子以共用电子对的形式形成配位键。蛋白通过这几种作用机制与胶体金颗粒牢固、稳定、紧密的结合，标记成功与否很大程度上取决于这三种氨基酸在标记蛋白质上的数量和位点。当这几种氨基酸残基位于抗体的抗原结合部位或抗原的特异性抗体结合位点时，可能出现空间位阻干扰。为了在免疫检测中获得最佳灵敏度，胶体金与这三种和标记相关的氨基酸的正确结合非常重要。就标记抗体来说，这三种氨基酸应定位于Fc区，而对于标记抗原，它们应当远离抗原的反应决定簇位置。
胶体金标记所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，因此标记往往在低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的标记物往往不稳定，把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的标记物。
当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，因为蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI（等电点）时为中性，此时蛋白水化程度最小，溶解度最小，最容易吸附到疏水的水的金粒子表面。但在实际的胶体金标记物制备中，标记缓冲液PH调整为PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同，对于高等电点的免疫球蛋白，在碱性pH条件下进行偶联能提高偶联产率，但注意多克隆抗体可能与单克隆抗体有截然不同的平均等电点，对于许多蛋白质（特别是抗血清来源的免疫球蛋白）而言，平均等电点是一个涵盖较宽pH范围的宽带。对于理化性质不确定的蛋白，要通过试验确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值，过量的蛋白与不同pH值的胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的标记物，在高浓度电解质（如NaCl）作用下也不会凝聚。
在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定标记物的最小蛋白量。在制备标记物时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚或不稳定的脱落，并严重影响标记活性。因为标记物溶液中的脱落蛋白容易抢先与待测物结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金标记物无法结合，在待测物含量较少的情况下要特别注意。为制备合格的胶体金标记物，通常做法是添加能防止氯化钠诱导聚集所需的最低蛋白量，并额外增加约10%-20%的量。这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。
总结一下：尽管蛋白质与胶体金标记的确切标准尚未达成共识，但遵循以下通用准则可提升工艺效率：(1) 在目标蛋白质等电点(pI)范围内或略高pH值条件下进行吸附反应；(2)向金纳米颗粒添加的蛋白质量应略高于（约10%）维持胶体稳定性所需的NaCl添加阈值；(3)避免蛋白质过量负载，以防引发后续结合物质的脱落；(4)标记蛋白应使用单体，避免使用大聚体，标记前可通过过滤去除大聚体；（5）标记过程在低离子强度缓冲液中进行；(6)通过测定溶液在580nm波长处的吸光度，评估吸附程度及金纳米颗粒的相对凝聚状态。
标记完成之后，需要对标记物进行封闭，金颗粒表面封闭一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。常用的封闭液为终浓度1%的BSA或0.3%的Casein（溶解在PH 8.0的Tris缓冲液中）。
标记物制备完成后，需要复溶至合适的浓度，然后喷涂到结合垫上进行干燥，复溶液的配方对于产品性能也至关重要。
来源：IVD二十载
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