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生物素亲和素系统在免疫诊断试剂中已被广泛应用，在ELISA和化学发光试剂的应用场景主要有两个方向，一个是将链霉亲和素固相化，生物素标记捕获材料，利用生物素和链霉亲和素的强亲和力间接实现捕获材料的固相化，例如罗氏化学发光试剂的磁微粒组分R1包被的是链霉亲和素，生物素标记活材和钌标记活材分别是R2和R3，此方案的优势有两个方面，一是所有产品的磁微粒组分R1可以通用，生产和使用非常方便，二是生物素标记活材和钌标记活材可以实现均相反应，反应结束后加入的R1组分只是起到分离免疫复合物的作用。生物素亲和素系统的另一个应用场景是信号值放大，酶等示踪材料不直接标记检测抗体，而是由生物素标记检测抗体，链霉亲和素标记示踪物，免疫反应结束之后洗去杂质，加入链霉亲和素标记示踪物，实现信号放大作用，最高可以实现信号提升5-10倍，主要应用在免疫组化中，也用于一些需要提高灵敏度的产品中。在免疫层析试剂的设计中也可以考虑使用生物素亲和素系统的这两个应用场景，提高检测灵敏度，有文献报道能达到提高灵敏度效果的方案有以下三个。

1.链霉亲和素(SA)划T线

常规的层析产品设计是T线包被捕获抗体，胶体金或荧光微球标记检测抗体，样本上行到结合垫时将标记抗体溶解，并开始发生免疫反应，免疫复合物继续上行，在经过T线时被T线包被的捕获抗体捕获形成夹心复合物，T线的宽度一般只有1mm，带有示踪物的免疫复合物被T线捕获的时间就是其流经T线的时间，非常短，如果T线的捕获抗体亲和力不强，大部分带着示踪物的免疫复合物就不被T线捕获而损失，导致信号强度偏低。如果采用生物素亲和素系统，在T线划链霉亲和素，生物素标记的捕获抗体喷涂在样品垫或结合垫上，胶体金或荧光微球标记检测抗体喷涂到结合垫上，样本上行时将生物素标记的捕获抗体和示踪物标记的抗体溶解并发生反应，免疫复合物在随样本上行过程中就开始形成，形成时间远长于常规方案在T线的一过性反应时间，另外T线的链霉亲和素与生物素亲和力也远高于抗原抗体的亲和力，因此夹心复合物在T线被捕获的效率高于常规方案。海肽生物发的研究文章显示，在cTnI荧光层析产品上采用此方案灵敏度可以提升2-4。

此方案T线包被的链霉亲和素一般是多聚体，用5mm PB配置为1mg/mL，1ul/cm划线，干燥备用。多聚体与NC膜有更好的吸附力，能结合更多的生物素抗体。生物素化抗体量配制呈0.1-0.2mg/ml，按照3ul/cm喷涂到样品垫或结合垫，折算到每人份的抗体用量低于直接划T线的抗体量。鉴于样本中存在生物素干扰的风险，且生物素干扰程度与样本量直接相关，因此如果使用大样本量检测必须要考虑这个因素，如果使用10倍以上的稀释样本，生物素干扰的风险就可以忽略。

生物素标记抗体：

2.链霉亲和素(SA)偶联微球

在ELISA、化学发光和免疫组化平台上，捕获抗体与样本和生物素标记抗体形成免疫复合物之后，洗涤去除杂质，然后加入链霉亲和素标记的酶结合物，这种反应模式相对于标记抗体直接标记酶结合物，可以显著提升信号值，达到提高灵敏度的效果，最高可以提升10倍以上。在层析平台上也可以借鉴此方法，T线位置固定捕获抗体，生物素标记抗体与链霉亲和素偶联的胶体金/微球混合成复合物，喷涂结合垫，加入样本后，在T线位置最终会有更多的胶体金/微球复合物被捕获，从而提高信号值。

此方法灵敏度能否提高的关键在生物素化抗体与链霉亲和素偶联的胶体金/微球的混合比例，若是向链霉亲和素偶联的胶体金/微球中加入生物素化抗体，应做几个浓度梯度，尽量降低生物素化抗体的添加量，另外注意混合的过程中不能出现凝集。

3.链霉亲和素(SA)桥联微球标记的生物素化抗体

传统的侧向层析试剂是在T线固定捕获抗体，微球上偶联标记抗体。改进方法的T线仍旧固定捕获抗体，标记抗体不直接偶联胶体金/微球，而是标记生物素后再偶联胶体金/微球，通过使用链霉亲和素将胶体金/微球标记的生物素化抗体桥联形成复合物，从而增强检测区域的分析信号。每个链霉亲和素分子含有四个生物素结合位点，能与吸附在金纳米颗粒表面的生物素化抗体形成高亲和力结合，当将链霉亲和素添加到金纳米颗粒与生物素化抗体的复合物中时，链霉亲和素分子充当了金纳米颗粒之间的高效交联剂，会促使多个较小尺寸的金纳米颗粒聚集成团。由此形成的纳米颗粒聚集体将导致检测信号的放大，在PCT（细菌感染和脓毒症标志物）的检测中可将检测限降低四倍。

制备链霉亲和素桥联复合物这个步骤非常关键，在胶体金/荧光微球偶联的生物素抗体溶液中加入链霉亲和素，需要通过试验确定最佳的链霉亲和素添加量。为了获得最佳的复合物，按15：1、15：3、15：5、15：10的比例添加链霉亲和素，室温反应15分钟，然后喷涂到结合垫上干燥。文献报道的最佳量是15:1，即链霉亲和素量尽量少。

注：1,2,3,4分别代表链霉亲和素的添加量为15:1,15:3,15:5,15:10

按照上面的方法将抗体标记生物素，关键在于生物素标记抗体的摩尔比，摩尔比过低，游离抗体会竞争结合待测抗原，灵敏度低，摩尔比过高可能导致加入链霉亲和素桥联时出现大聚体甚至沉淀。最佳的摩尔比需要通过试验确定，建议抗体浓度为1-4mg/ml时，生物素标记抗体的摩尔比为5-10。

[2] Serebrennikova K V , Samsonova J V , Osipov A P .Enhancement of the Sensitivity of a Lateral Flow Immunoassay by Using the Biotin–Streptavidin System[J].Moscow University Chemistry Bulletin, 2018, 73(3):131-134.

来源：IVD二十载

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