固相免疫分析法通过被动吸附或共价偶联作用，将生物分子（主要是蛋白质）固定在表面。固相表面与蛋白质和其他生物分子相互作用的能力是其基本特征，但是，在后续步骤中，其他蛋白质或生物分子与固相表面未占据空间的非特异性结合（NSB）可能对检测结果的特异性和灵敏度造成影响。另外一些因素也可能影响NSB，例如每个ELISA系统/产品独有的蛋白质间相互作用，比如，包被蛋白和标记蛋白之间的非特异性吸附作用，包被蛋白和样本中未知物质的非特异性吸附作用等，这些因素在检测方法开发和优化过程中必须予以考虑。需要注意的是，几乎任何两个物质之间都存在一定程度的吸附作用力，尤其是在大分子物质之间，只不过作用力的大小不一样，想象一下不小心将一滴墨水滴到不同材质上的场景，滴到桌面上可以被擦拭掉肉眼看不见，但实际上桌面上仍残留有一小部分，滴到毛巾上就很难再去除到肉眼观察不到的程度。
通过使用封闭试剂（即用于抑制非特异性结合的多种物质的统称）使未结合位点饱和，可有效降低表面非特异性结合。封闭试剂和方法通常采用经验性选择，因为尚未有适用于所有应用的单一标准化方法。然而，对于任何特定的应用或检测方法，若基于固相表面类型、固定于表面的生物分子（Capture）类型以及所采用的标记物（Detection）类型，选择合适的封闭试剂，通常都能找到合适的方法。
封闭试剂主要分为两大类：蛋白质类和去污剂类（通常为非离子型）。两种试剂各有优缺点，理想的封闭试剂应具备以下特性：
ü 抑制检测组分/标记物与表面的非特异性结合（包括被动结合和共价结合）。
ü 抑制蛋白质间非特异性相互作用。
ü 与后续检测组分（如抗体、蛋白A）无交叉反应性。
ü 减小活性材料在固相表面的活性丧失，从而稳定生物分子或协助其恢复天然构象。
ü 具有低酶活性，或可能干扰检测的其他活性。
ü 不破坏将蛋白质或生物分子固定在表面的作用力。
ü 所有批次均表现出一致且可重复的性能。
针对任何特定检测，最佳封闭试剂和方法都是经过优化的，有很大可能性需要在低本底和高灵敏度之间进行平衡。封闭剂使用过程中常见的问题如下：
ü 批次间不一致（牛血清白蛋白、鱼明胶和动物血清的来源批次间质量存在差异）。
ü 干扰特定的蛋白质间相互作用，例如鱼明胶更倾向于阻断蛋白质间的相互作用，而非蛋白质与表面的结合，因此可能导致对特异性结合的抑制作用比非特异性结合更强。
ü 分子多样性不足（多数单分子封闭试剂因缺乏多样性，难以有效阻断由疏水、离子及共价构成的表面结构）。
ü 与检测组分的交叉反应性（如蛋白质A会与哺乳动物血清中的IgG分子发生交叉反应）。
ü 生物分子与固相表面间非共价键的断裂（如非离子型表面活性剂可置换疏水性结合的蛋白质及生物分子）。
ü 内源性酶活性、固有荧光等因素干扰检测。
去污剂/表面活性剂类封闭剂
去污剂是主要的封闭试剂之一，包括非离子型和离子型表面活性剂。在固相免疫分析中，离子型去污剂很少被单独用作阻断机制，原因是它们具有破坏离子键和疏水性作用力的倾向，可能导致蛋白质的构象变化，具备溶解蛋白质的能力，并倾向于抑制（或终止）酶-底物反应。两性离子表面活性剂封闭效果较差，因此不被用作封闭剂。通常作为封闭剂使用的表面活性剂是非离子型的，其中最常见的是Tween 20。表面活性剂属于临时性封闭剂，类似于细胞膜，处于流动的动态变化中，无法在固相表面形成永久性屏障，其封闭作用可通过水洗或水性缓冲液冲洗去除，因此不单独作为固相载体的封闭剂使用。表面活性剂主要用在样本稀释液、标记物稀释液，与蛋白质封闭剂配合使用，在免疫反应后的洗涤步骤，表面活性剂通过封闭生物分子在固相表面解吸附而暴露的区域，提供额外的便捷且经济的封闭效果，从而提升检测性能。另外，在洗涤缓冲液中添加非离子表面活性剂，可以增强洗涤效果，同时对固相表面起到临时封闭作用，Tween 20是最佳选择，Triton X-100虽能有效阻断非特异性结合，却会显著削弱特异性结合，导致假阴性结果，需降低使用浓度，浓度范围0.01%-0.1%最为常用。非离子表面活性剂具有以下优点：
ü 表面活性剂需要在大于临界胶束浓度（CMC）时才能起到作用，非离子表面活性剂的CMC很低，例如吐温20的CMC浓度范围为0.01%至0.10%，因此低浓度就够用，价格低廉。
ü 稳定性极佳，可长期以稀释形式（如洗涤缓冲液）保存于室温环境中，且不会出现封闭活性的任何损失。
ü 洗涤液中添加这类成分能有效发挥作用：一方面能封闭固相表面在洗涤过程中被物理剥离的区域；另一方面还能使固相表面不牢固的结合（如非特异性结合）松动，易于被洗涤下来。
蛋白质封闭剂
蛋白质封闭剂具有双重作用：一方面封闭表面未结合位点，另一方面通过分散并稳定表面结合的生物分子，有效降低固相检测中常见的空间位阻和变性问题。与非离子型表面活性剂不同，蛋白质通过被动吸附或化学链接固定在在固相载体表面，属于永久性封闭剂，但常规操作中，通常会在后续检测反应所用的稀释液中再添加蛋白质封闭剂，以进一步降低背景干扰并稳定标记物分子。目前最常用的蛋白质封闭剂包括：牛血清白蛋白、脱脂奶粉或酪蛋白、全血清以及鱼胶原蛋白，每种封闭剂都有其优缺点。
牛血清白蛋白
牛血清白蛋白（BSA）通常以1%至3%的浓度使用。该试剂价格低廉，可干燥保存。已有充分文献报道BSA作为封闭试剂的使用效果，其对中高吸附性的微孔板表面，以及活化后的共价微球表面，蛋封闭白质非特异性结合的性能已得到验证。BSA作为封闭剂的缺点有：
ü 批次间差异性，包括脂肪酸含量（用作封闭试剂的牛血清白蛋白应不含脂肪酸）、金属离子含量、聚体大小、蛋白酶、未知的杂质，这种差异很可能来自于制备BSA的原料之间，这种差异在不同产品的应用中表现不一样，有些产品对这些差异非常敏感。
ü 可能存在与抗磷酸酪氨酸抗体发生交叉反应的磷酸酪氨酸，导致间接法检测的假阳性。
ü 与抗牛血清白蛋白-半抗原偶联物免疫制备的抗体发生交叉反应。
ü 缺乏封闭某些共价表面所需的多样性（具有疏水性、离子性和共价特征的表面）。
尽管存在缺点，BSA仍是固相免疫分析中最常用的封闭试剂。
脱脂奶粉和酪蛋白
脱脂奶粉（Non-fat dry milk，NFDM）通常使用浓度为0.1%至0.5%，价格相对便宜，但不同制剂的质量参差不齐，若未妥善制备和储存，都容易快速变质。酪蛋白（Casein，一种脱脂奶粉成分）可用作脱脂奶粉的替代封闭试剂，但其在水性缓冲液中的溶解性比NFDM差，因此常用的是酪蛋白钠盐，溶解性更好些，但在PH<6的溶液中溶解仍较慢。1%浓度脱脂奶粉和酪蛋白在水溶液中不似BSA那样澄清透明，其疏水性较强，在溶液中以多聚体形成的胶束形式存在，这或许能解释为何在固相载体表面，它比BSA的封闭效果更有效。虽然 NFDM与Protein A兼容，且与免疫分析组分的交叉反应性极低，但仍存在以下反应性问题：
ü 牛奶中含有磷酸酪氨酸，这种物质能与抗磷酸酪氨酸抗体发生反应，封闭到固相载体上时，可在间接法检测中可能出现假阳性。
ü 某些 NFDM 可能含有干扰抗DNA检测的组蛋白。
ü 某些 NFDM 可抑制碱性磷酸酶活性。
总体而言，由于NFDM和酪蛋白分子的多样性和两亲性特征，是一种优秀的封闭试剂， 是许多共价表面的首选封闭试剂。
鱼明胶
鱼明胶是深海鱼皮纤维蛋白降解产物，虽是常用的封闭试剂，但存在明显缺陷。单独使用时效果欠佳，是本文讨论的固相表面封闭剂中最不给力的。它主要阻断蛋白质间的相互作用，有时会掩盖固相表面结合的蛋白位点，进而干扰免疫反应活性，明胶的这些特性可能会导致更高的背景和更低的灵敏度。另外明胶的质量也往往因批次而异。鱼明胶最大的优势是它与哺乳动物抗体和Protein A没有交叉反应性。
全血清
对于极难处理的封闭问题，建议使用浓度为10%的全血清，常用小牛血清或新生牛血清。如果试剂使用了山羊或绵羊抗体做包被或标记，试剂组分的样本稀释液或标记物稀释液中需要相应添加山羊或绵羊血清。由于全血清具有分子多样性，能有效封闭生物分子与表面（被动吸附）的相互作用、生物分子与共价表面的相互作用，以及蛋白质间的相互作用，同时还能起到稳定蛋白质的作用。使用常规全血清作为封闭试剂的缺点主要在于其与蛋白A及抗IgG抗体存在交叉反应性。由于多数免疫检测采用标记的抗IgG二抗系统，使用正常哺乳动物血清进行封闭处理时，可能因交叉反应问题导致假阳性结果和高非特异性结合。此时可选用鱼类或鸡血清作为替代品，两者均不存在哺乳动物同类物的交叉反应性问题，同时保留了分子多样性这一优势。
高分子化合物封闭剂
蛋白类封闭剂分子量大，有疏水基团和亲水基团，也有相当数量的氨基、羧基等化学基团，不管是用到被动吸附还是共价交联的固相表面，都能够起到很好的封闭和保护效果，用到样本稀释液和标记物稀释中，也能很好的抑制蛋白间的非特异性吸附和标记生物分子对容器壁的吸附。但是这些封闭蛋白来源于动物，批间差在所难免，另外其中含有的动物源物质可能会干扰某些产品的检测，对有些产品并不适用。表面活性剂类封闭剂分子量小，对固相表面的封闭不牢固，不适合单独用于固相表面的封闭，常与蛋白一起用于样本稀释液、标记物稀释液，或用于洗涤液，在免疫反应和洗涤过程中起到抑制非特异性吸附、流动封闭、增强洗涤效果的作用。随着检测灵敏度的提升和固相表面类型的多样化，需要既能兼具蛋白和表面活性剂的优势，又能避免批间变异和潜在干扰，可发挥多种功能的高分子量化合物类封闭剂。常见的这类替代封闭剂包括聚乙二醇（PEG）类、聚乙烯醇（PVA）类和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）类聚合物。另外，也有一些商品化的高分子化合物封闭剂，有三种类型供参考：
封闭共价交联固相表面
Blockmaster™ CE510和CE210是完全合成的水溶性封闭试剂，由亲水性PEG尾和多个胺端基组成。PEG尾可减少非特异性结合，胺端基可与胺反应表面共价结合。核心特性：
ü 由亲水性PEG尾链与多个胺基末端组成的独特结构
ü 通过共价键结合实现高耐久性
ü 低非特异性结合蛋白质/细胞
ü 优化抗体排列方向提升信号增强效果
ü 珠粒分散性显著改善
非离子型封闭被动吸附固相表面
Blockmaster TM DB1130，在高分子链中导入了最佳比例的亲水基团和疏水基团，使其具有优异的封闭效果，相比生物制品（牛血清白蛋白、酪蛋白等），不含有动物由来的蛋白质，没有病原体污染，产品质量稳定，不存在批次差别，可以完全替代BSA，可以用于免疫比浊和化学发光微球的封闭保存。
Blockmaster TM PA1080，针对层析膜和微孔板开发的封闭剂，全化学合成，无病毒和动物源蛋白，非常好的批间稳定性。减少蛋白残留，防止细胞黏附，蛋白稳定剂。分子量大于DB1130，结构上属于支链DB1130。
离子型封闭被动吸附固相表面
Biolipidure®是基于MPC的一系列聚合物，MPC由磷酰胆碱基团和甲基丙烯酸基团组成。磷酰胆碱基团是磷脂的亲水部分，存在于生物体的细胞膜上。磷酰胆碱基团可以具有以下功能：高生物相容性、高亲水性、高润滑性和高抗凝血性。甲基丙烯酸基团能够使MPC与各种共聚单体聚合，为制备各种MPC聚合物提供了无限的可能性，适于以各种目的修改各种基材。Biolipidure®表现出多种功能，例如抑制蛋白质的非特异性吸附、蛋白质的稳定化、免疫测定中的敏化等。Biolipidure®是完全合成的材料，具有优异的稳定性、很少的批次间差异以及很小的生物危害性风险，超越了基于蛋白质的试剂，即牛血清白蛋白（BSA），酪蛋白等。
Biolipidure®有一系列不同分子量（粘度）、亲疏水性（表面张力）的物质，在免疫层析、化学发光、免疫比浊等平台应用中起到提升灵敏度、抑制非特异性吸附、抑制微球凝集等作用，但是具体需要根据各自产品的技术平台和所用的材料特点筛选适用。
被动吸附固相表面的封闭方案
单纯的疏水性表面通常被称为中等结合表面（如中结合力ELISA微孔板）。这类表面可用非离子表面活性剂和蛋白质阻断剂进行有效封闭。根据实验经验，0.02% Tween 20与1% BSA的联合使用是大多数检测的理想方案。
兼有疏水性和离子性的表面通常被称为高结合表面（如辐照过的ELISA微孔板、羧基表面聚苯乙烯微球）。由于高结合力表面对抗体及其标记物有更强的吸附能力，因此比中等结合表面更难被封闭。建议联合使用非离子型去污剂（0.02% Tween 20）和蛋白质封闭剂（1% BSA、0.2% 脱脂奶粉/酪蛋白钠、10%正常血清等），蛋白质封闭剂的选择更多取决于检测所用的活性生物分子，而非表面本身。
对于带高电荷且几乎不带疏水基团的表面，必须使用蛋白质进行封闭处理。由于离子表面通常仅用于固定小分子离子化合物，因此所选封闭需兼具两个特性：既要保持较小尺寸以避免遮蔽目标捕获分子，又要具备适当的离子特性以便与表面电荷相互作用。大多数检测可使用BSA（1-3%）或脱脂奶粉（0.2-2%）；但当表面包被的是分子量很小的生物分子时，可能需要使用乙醇胺（10%）封闭，非离子表面活性剂无法有效阻断带电表面。
共价交联固相表面的封闭方案
氨基表面，使用双功能试剂交联剂时，需用蛋白质封闭未交联的共价结合位点、疏水位点、离子位点，建议尽可能使用脱脂奶粉（0.2%至2%），或使用10%正常血清作为主要封闭试剂。非离子型表面活性剂在此类表面封闭效果不佳，在洗涤缓冲液中加入吐温20，可有效清除未结合且被物理吸附的生物分子。
活化的共价表面（如EDC活化的羧基、甲苯磺酰基、环氧基等）通常由疏水区和共价区组成。两亲性蛋白往往是封闭共价表面最有效的物质，通常用BSA。非离子表面活性剂不会阻断共价相互作用，但无论使用何种表面，都建议在洗涤缓冲液中添加非离子表面活性剂。
不管是被动吸附表面还是共价交联表面，首选的封闭剂是蛋白，常用的是0.5-1%BSA和0.2%-0.5%脱脂奶粉/酪蛋白钠，或者使用前面介绍的高分子化合物。不建议在封闭液中使用高浓度表面活性剂，或者干脆不要使用表面活性剂，因为表面活性剂与蛋白同时存在时，会抑制蛋白对固相表面的吸附，而表面活性剂本身对固相表面的封闭作用并不牢固，最终会导致对固相表面的封闭效果下降。表面活性剂主要用到样本稀释液、标记物稀释液、洗涤液中最优。
来源：IVD二十载
声明：本网站注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！
