表面活性剂在层析产品中的应用
1表面活性剂在样品垫中的应用
样品垫的作用是接受待检样品，使样品均匀分布，同时尽量少的截留待测物质。样品垫的物理性质、化学成分、处理方式以及材质本身都对测试试纸条的实验结果产生重要的影响。常见的材质有玻纤、滤纸、无纺布等，其中以玻纤居多。玻纤在处理前称为光玻纤，有着巨大的表面，很难快速吸收水分子，必须经过处理之后才能使用在试纸条中。通常处理玻纤的溶液添加有缓冲盐、蛋白质、表面活性剂、粘性增强剂等物质。由于结合垫和标记物复溶液中都不能添加过多的表面活性剂，因此表面活性剂主要添加到样品垫中，有如下几种作用：
增加亲水性避免T 线反白：玻纤处理液中添加一定的表面活性剂之后，显著改善光玻纤的润湿现象，液体标本接触样品垫时很容易进入玻纤内部，有助于更多更快地吸收样本，并快速与玻纤内各种组份发生作用，连续均匀地将样本释放到结合垫上。另外样品垫中的表面活性剂随样本上行后，有助于溶解结合垫上的标记物，在流动过程中对NC膜进行封闭。若玻纤处理液中只含有缓冲盐不添加表面活性剂，试纸条容易出现T 线反白、背景不干净、金标残留现象。T 线反白现象主要是由T线位置结合的蛋白（抗原或抗体）的疏水性质导致的。当含有样本的液体流过T-线位置时，蛋白质裸露在外的亲水部分很容易被润湿，而对于裸露在外的疏水部分，若不能在短时间内被润湿，液体就会绕过T线，出现反白现象，影响最终的显色。表面活性剂可以与蛋白质的疏水链结合，增强T线亲水性，从而实现蛋白与标记物的正常结合。但是，倘若T线蛋白疏水性较强，通常情况下的表面活性剂也难以克服反白现象，这时适当增大表面活性剂的浓度，反白现象会有所改善。若还是不能改善，需要尝试在T线划膜液中添加表面活性剂。样品垫中常用的表面活性剂有S19（TWEEN 20）、S20（TWEEN80）、S14 （TRITON X-100）、S9（Tetronic 1307），添加浓度建议在0.5%-1%。
避免线条中空现象：线条中空现象是指C/T 线显色时，线的中间好像有些地方没有覆金标或乳胶，线条中间有明显的空白区域，导致测试条的C 线或T 线颜色不均、不饱满。一般有两大原因导致此现象：一是是表面活性剂的亲水作用不够；二是金颗粒或乳胶颗粒太大或释放不均一。一般可通过以下措施进行优化：①提高C/T 线的划膜原料浓度；②在C/T 线划膜液中加入一些物质改善亲水性，如各种表面活性剂，甲醇/乙醇，糖等；③改变样品垫中表面活性剂种类和增加浓度，提高金标的再溶解能力；④优化标记条件，去除大颗粒标记物，使金颗粒或乳胶颗粒大小尺寸尽量一致。
避免背景不净现象：试纸条的背景不干净主要是因为金标记物滞留在了膜上，由于背景留有金标或乳胶的颜色，人为判读通常会下降半个到一个档次。导致背景不干净的原因有很多，比如膜孔径太小，金标颗粒太大，在向上测流过程中直接堵住了膜；试纸条装配过程中不是平置而是有一定弧度放置，流体流动受阻导致金颗粒被滞留；当然也不能忽视表面活性剂的作用，因为NC 膜是疏水膜，样品垫内完全不加任何表面活性剂时，会直接导致颗粒滞留在膜上，可以明显的看到背景呈现金标颗粒的红色。当在玻纤中添加低浓度的表面活性剂时，试纸条背景不干净现象有所减轻，但还是会略有部分金标残留在膜上，背景泛红，当增大表面活性剂浓度后，可以完全改善，表面活性剂的存在，促进了金标颗粒和液体标本的融合，一起实现在疏水NC 膜上的侧向流动。试纸条背景干净，不会影响测试结果的判读。
避免背景stream 现象：stream 现象就是在跑板过程中发现金标在随流体在向上跑板过程中，背景出数条深浅不一的竖直方向的线条，而正常情况下的背景应该是跑板过程中，金标和样品标本以基本一致的速度向吸水垫方向流动，且流体色泽均一。导致stream 现象的原因可能有三，一是表面活性剂的浓度偏小，亲水性能不够，这个原因的可能性较小，但也是有一定的作用。还有一部分原因可能是玻纤中的粘度增强剂（如PVP）的添加量不够所致，PVP 有助悬、增稠和保护胶体作用，也有一定的金标粘合作用，提高金标的再溶解能力，在跑板过程中，有助于标记物和标本的均匀释放，所以适当的添加表面活性剂和PVP，能在一定程度上改善stream 现象。最后一个原因在于承载金标的结合垫材质，这也是可能性最大的原因，由于结合垫是多孔非均一结构，干燥到结合垫上的标记物在遇到溶液释放过程中，由于表面结构有差异，从而使金标释放出现差异，直接导致跑板出现stream 现象。尝试不同厂家和型号的结合垫材质，可以改善此现象。
表面活性剂的种类筛选：样品垫中会首选非离子表面活性剂，因为非离子表面活性剂无带电基团，不会与抗原/抗体发生静电干扰，能完整保留二者的空间构象和结合活性；临界胶束浓度低，有很好的润湿和抑制非特异性吸附的能力；全血检测时不易溶血。使用频率最高的表面活性剂中有S14 （TRITON X-100）、S19（TWEEN 20）、S20（TWEEN80）和S21(BRIJ 35)。离子型表面活性剂带有正/负电荷，会与抗原/抗体表面的带电基团（如氨基酸的氨基、羧基）发生静电相互作用，可能影响抗原抗体的结合，甚至导致蛋白变性（如SDS会使抗体的空间构象解折叠，失去结合抗原的能力）；而且还有较强的溶血作用，全血检测中导致血红细胞释放，跑板的背景非常红，影响判读。两性离子表面活性剂S9（Tetronic 1307）是一种大分子量的弱表面活性剂，对抗原/抗体的活性影响较小，如果产品对以上常用的表面活性剂都不适用，可以考虑试用S9。
样品垫中还常常会添加聚乙烯基吡咯烷酮PVP-K30，PVP属于人工高分子聚合物，具有以下作用：增溶作用，能增加某些基本不溶于水而有活性的物质的水溶性；分散作用，可使溶液中的有色物质、悬浮液、乳液分散均匀并保持稳定，蛋白可以与PVP 的N 原子和O 原子形成氢键而发生复合作用，使蛋白稳定分散在流体中；吸附作用，吸附在界面上并在一定程度上降低界面表面张力；粘度改善作用，作为固体颗粒的粘合剂，促使金标或乳胶颗粒与标本液体的融合，降低液体流速提高灵敏度。在层析产品玻纤中添加的浓度一般为0.5％。
2表面活性剂在结合垫中的应用
结合垫的材质主要是玻璃纤维和聚酯膜，需经过预处理以确保喷涂干燥在上面的标记物有合适的释放速度和良好的稳定性。结合垫处理液中通常含有蛋白、表面活性剂、蔗糖等，蛋白可以预先非特异性的结合到玻璃纤维或聚酯膜纤维上，对其进行封闭，防止金颗粒或乳胶颗粒喷涂上后牢固的吸附到结合垫上，导致后续释放困难。表面活性剂更多的是起到表面润湿作用，当液体上行到结合垫时，含有表面活性剂的水溶液更容易把金颗粒及结合垫纤维表面润湿，使胶体金标记物在聚酯膜表面上的粘附强度减弱，在毛细层析外力作用下更容易从结合垫纤维表面上释放。表面活性剂在结合垫上的应用一般是直接添加在结合垫的处理液中，常用的表面活性剂种类与在样品垫中使用的相同。与样品垫中的使用情况不同，结合垫中表面活性剂的使用浓度不能高，能达到润湿效果即可，处理液中过多的表面活性剂会抑制蛋白对结合垫纤维的封闭作用，反而会导致胶体金标记物与未封闭完全的结合垫纤维有更牢固的吸附力，导致释放问题。另外胶体金标记物喷涂到结合垫上之后，过高的表面活性剂还可能使胶体金上标记的蛋白在长期存放过程中脱落。因此结合垫处理液中表面活性剂的添加浓度一般是0.1-0.2%。
3.3表面活性剂在硝酸纤维素膜上的应用
硝酸纤维素膜（NC膜）本身是非常疏水的，我们用的NC膜之所以很容易被润湿，是因为在NC 膜的制造过程中加入了一些表面活性剂，而且不影响蛋白质吸附和测试功能。在膜的制造过程中，表面活性剂具体使用的种类和浓度是根据免疫层析检测的需求而调整的。NC膜处理的表面活性剂对膜毛细速度、蛋白质吸收、C/T 线条和线条结合宽度的影响。
表面活性剂对膜毛细速度的影响：表面活性剂只需要在很低的浓度就可以使得原本疏水的硝酸纤维素膜变成亲水性的，一旦表面活性剂在膜中的浓度达到这个低浓度之后，继续增加表面活性剂的浓度对膜的亲水性改进就不会明显。但是在膜生产中，为了够保持膜毛细速度的稳定，表面活性剂的浓度要高一点。在NC膜生产中具体选用何种表面活性剂和该表面活性剂使用多少的浓度，与表面活性剂在样品垫的使用一样，都是在生产过程中慢慢摸索和调整出来的。
表面活性剂对蛋白质吸附的影响：干扰蛋白与膜结合的物质大体上可以分为四种类型：非特异性蛋白（如BSA，动物血清）、静电干扰物质（高浓度氯化钠）、氢键干扰物质（如尿素，甲酰胺）、疏水作用干扰物质（表面活性剂，高分子物质）。过高浓度的表面活性剂会显著影响膜对蛋白的吸附，如Tween系列，Triton系列和Brij系列表面活性剂。高分子化合物聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG)，泊洛沙姆这类人工多聚物也会干扰蛋白和膜之间的结合。如果因为以上原因导致蛋白与膜之间的结合力不够，就会出现多种问题，例如T线强度变弱，检测灵敏度降低；T线扩散，变宽变弱，不如正常情况下显色清晰；T线位置蛋白被上行的液体冲走，原本已结合显色的标记物，逐渐褪色。所以应对的措施就是尽量避免NC 膜在T/C线划膜之前污染到上述物质。但是在有些产品中，T线划膜溶液中会添加一定浓度的PVA 和Tween20，可以改善T线反白现象，添加量一般不高于万分之五。
表面活性剂对线条结合宽度的影响：当表面活性剂在膜中的浓度增加的时候，划线时T/C线会向两边和膜深处扩散更远，导致最终显色的宽度更宽，显色变弱；另外蛋白与膜的结合也可能不牢固，标记物结合上之后在膜上有扩散的现象出现。
表面活性剂对膜后处理的影响：一般产品在T/C线划线后干燥即可，不需要对膜进行后处理。对于某些需要后封闭的产品，在抗原(或抗体) 与膜结合后，还要进行两步处理。第一步是干燥，使抗原(或抗体) 能够维持免疫反应活性并与膜牢固结合，抗原(抗体)与硝酸纤维素膜牢固的结合需要足够的干燥温度和时间，如果不足会影响整个的试验稳定性。第二步是使用封闭剂将膜上未结合位点封闭以防非特异性吸附，封闭剂应该封闭所有未结合位点而不竞争掉膜上已经结合的抗原（或抗体）、也不与已经结合的抗原（或抗体）或检测物质有交叉反应。常用的封闭剂有蛋白质(脱脂奶粉、Casein、BSA) 、人工多聚物( PVP-33KD、PVA-15KD、PEG-20KD) 、表面活性剂( Tween 20 、Triton X-100)。具体选用何种物质和选用何种浓度，还是要作大量的试验才能确定。如果要在封闭过程中使用表面活性剂，要尽可能的减低浓度，在封闭液中的浓度往往小于在样品垫中的浓度,一般相应的推荐使用浓度Tween-20 和Triton-X100 小于0.05% （v/v），PVA，PVP 和PEG 小于0.5% (v/v)，蛋白0.3-1%。
来源：IVD二十载
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